Parasitic infections represent a significant global health burden. Simultaneously, parasitic infections have been found to exert a regulatory influence on the host’s immune system by modulating immune responses and dampening inflammation as part of their survival strategy, providing mechanisms, that could be exploited for drug development in autoimmune diseases and allergic reactions. Therefore, the intricate interplay between parasitic organisms and their hosts remains a subject of intense research. Heligmosomoides Polygyrus, a naturally occurring model organism, that has emerged as a valuable tool for studying host-parasite interactions and immunoregulation due to its well characterized life cycle and its relevance to gastrointestinal autoimmune diseases in mammals is used here. In spite of the largely characterized composition and effects of H. polygyrus Excretory–Secretory Antigen on the host, little is known about the parasites defense mechanisms or metabolic pathways. This study employs multi-photon Nicotinamide Adenine Dinucleotide (Phosphate) Oxidase (NAD(P)H) Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) to shed light on the dynamic metabolic interactions and relationship between live intestinal nematodes and their host that plays a pivotal role in survival, pathogenicity and a fundamental understanding of immunological processes. The group around Prof. Dr. Niesner characterized the fluorescence lifetimes of NAD(P)H bound to 12 key co-enzymes around Pyruvatdehydrogenase (PDH) and Lactate Dehydrogenase (LDH), that take part in energy metabolic pathways, (like TCA), that in turn not only indicates cell respiration but also inflammation. This allows us to conclude indirectly the predominant metabolic pathway in the measured voxel. We successfully established a preparation pipeline for measuring two photon NAD(P)H FLIM of live nematodes in the explanted murine small intestine that can be defined as in-vivo like [Liublin, Rausch, Leben, Liebeskind, et al. 2023]. We have proven that with our pipeline the metabolic pathways and the occurrence of NAD(P)H mediated ROS in healthy mice, as well as the activity of tissue types of interest as the ratio between bound and free NAD(P)H of explanted duodenum are comparable with the activity of life tissue, paralleling literature. We have measured the preferred cell respiration and NOX/DUOX 1 2 abundance in segmented worm and host tissue over two weeks at four critical time-points during the acute phase of infection. Findings reveal that the nematodes show distinct metabolic signatures during the acute phase of the disease (14 days Post Infection (PI)) that suggest an adaptation to the host environment. From a more dormant state at day 6, the metabolic activity of the parasites increased steadily. These signatures further involve alterations in the RedOx state to cope for needs in energy production due to their moving patterns along their maturation and development. A steady shift from an anaerobic-glycolysis-respiratory-like pathway to an aerobic-glycolysis / Ox-Phos-like pathway is observable in the parasite over the cause of acute infection. At the same time the occurrence of ROS rises dramatically in segmented worm tissue in that same time frame. Parallel, defense reactions that are hijacked by the parasite to facilitate their survival and proliferation are identified in the host. An observable, initial strong increase in oxidative stress during the first days of infection in the host tissue is measurably reduced from day 10 onward (occurrence as % of measured and segmented, normalized to 100 μm3 tissue), paralleling literature. Our data on cell respiration in the early phase of acute infection shows that the host is producing energy less via anaerobic-glycolytic-like pathways, however, by day 14 the host’s metabolism reverts into its initial, healthy state, comparable with its respiration at day 6 PI. High demand and expression of Alcohol Dehydrogenase in stressed or wounded gut tissue can be measured, also paralleling literature. In summary, this research presents a novel application of multi-photon NAD(P)H FLIM in the context of parasitology, offering a deeper understanding of the metabolic adaptations employed by intestinal nematodes and their implications for host-parasite interactions, highlighting the feasibility and potential of this spatially resolved method as a powerful tool. This work additionally addresses viscosity changes in host mucus as another immunological interaction process and lays the foundation for deeper experiments with preliminary measurements of divers methods.
Parasitische Infektionen stellen eine erhebliche globale Gesundheitsbelastung dar [Pullan and Brooker 2008]. Neben ihren pathogenen Effekten modulieren Parasiten das Immunsystem des Wirts, indem sie Entzündungen unterdrücken – ein Mechanismus, der ihrer eigenen Überlebensstrategie dient. Diese Prozesse könnten für die Entwicklung neuer Therapieansätze bei Autoimmunerkrankungen und Allergien genutzt werden [Damian 1997]. Daher bleibt die Erforschung von Wirt-Parasit-Interaktionen ein zentrales Forschungsgebiet. In dieser Studie wird Heligmosomoides Polygyrus als Modellorganismus eingesetzt, da sein Lebenszyklus gut charakterisiert ist und er eine hohe Relevanz für gastrointestinale Autoimmunerkrankungen bei Säugetieren besitzt [Slater and Keymer 1986, Hang et al. 2010]. Während die Zusammensetzung und die Wirkung der exkretorisch-sekretorischen Produkte von H. polygyrus Ex-cretory–Secretory Antigen bereits weitgehend erforscht sind [Maizels et al. 2012], ist über die metabolischen Wege und Abwehrmechanismen des Parasiten wenig bekannt. Um diese Wissenslücke zu schließen, wurde multiphotonen Nicotinamide Adenine Dinucleotide (Phosphate) Oxidase (NAD(P)H) Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) genutzt, um die metabolische Dynamik lebender Darmnematoden und ihres Wirts zu untersuchen. Dies ist ein entscheidender Faktor für das Überleben, die Pathogenität und die immunologischen Wechselwirkungen des Parasiten. Die Forschungsgruppe um Prof. Dr. Niesner hat bereits die Fluoreszenzlebensdauern von NAD(P)H in 12 Schlüssel-Enzymkomplexen um Pyruvatdehydrogenase (PDH) und Lactate Dehydrogenase (LDH) charakterisiert, die zentrale Rollen in der Zellatmung und Krankheitsprozessen spielen [Martínez-Reyes and Chandel 2020]. Diese Methode ermöglicht es, indirekt auf die vorherrschenden Stoffwechselwege im gemessenen Voxel zu schließen [Leben 2021]. Wir haben erfolgreich eine Präparationspipeline für die Messung der zweiphotoneninduzierten NAD(P)H FLIM von lebenden Nematoden im exzidierten Dünndarm etabliert, die als in-vivo ähnlich bezeichnet werden kann [Liublin, Rausch, Leben, Liebeskind, et al. 2023]. Unsere Validierung zeigt, dass die untersuchten Stoffwechselwege, die NAD(P)H-vermittelte ROS Produktion in gesunden Mäusen sowie die Aktivität von Zielgeweben – bestimmt durch das Verhältnis von gebundenem zu freiem NAD(P)H – mit denen in lebendem Gewebe vergleichbar sind [R. L. Lindquist et al. 2018]. Im Verlauf von zwei Wochen wurde die Zellatmung sowie die Expression von NOX/DUOX 1 2 in segmentiertem Parasiten- und Wirtsgewebe zu vier kritischen Zeitpunkten während der akuten Infektionsphase analysiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass H.Polygyrus während dieser Zeit markante metabolische Anpassungen vornimmt, um sich an die Wirtumgebung anzupassen. Während der Parasit an Tag 6 post InfeKtion noch eine niedrige Stoffwechselaktivität aufweist, steigt seine metabolische Aktivität im Laufe der Infektion kontinuierlich an. Diese Veränderungen gehen mit Anpassungen des Redox-Zustands einher, die den Energiebedarf decken und mit Bewegungsmustern, Reifung und Entwicklung des Parasiten korrelieren. Über den Verlauf der akuten Infektion hinweg verlagert sich der Stoffwechsel des Parasiten von einem anaeroben-glykolytischen-respiratorisch ähnlichen Zustand zu einem aeroben-glykolytischen/Ox-Phos-ähnlichen Stoffwechsel. Parallel dazu steigt der ROS-Gehalt im segmentierten Wurmgewebe signifikant an. Auch der Wirt zeigt metabolische Anpassungen. In den ersten Tagen der Infektion ist eine starke oxidative Stressreaktion zu beobachten, die jedoch ab Tag 10 abnimmt – ein Befund, der mit bisherigen Studien übereinstimmt [Bouchery et al. 2017]. Unsere frühen Daten zur Zellatmung zeigen, dass der Wirt in der Anfangsphase der Infektion weniger auf anaerobe Glykolyse angewiesen ist. Bis Tag 14 kehrt der Stoffwechsel, beeinflusst durch den Parasiten, in seinen Ausgangszustand zurück und ähnelt dem respiratorischen Profil von Tag 6 post infection. Zudem zeigen unsere Messungen eine erhöhte Alcohol Dehydrogenase-Expression in gestresstem oder geschädigtem Darmgewebe, was ebenfalls mit der Literatur übereinstimmt [Gross, Salame, and Jung 2015, Aviello and Knaus 2018, Haselbeck and Duester 1997]. Diese Studie demonstriert die Anwendbarkeit von multiphotonen NAD(P)H FLIM als leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung metabolischer Wechselwirkungen in der Parasitologie. Unsere Ergebnisse liefern neue Erkenntnisse darüber, wie sich intestinale Nematoden metabolisch an die Wirtumgebung anpassen, und beleuchten gleichzeitig die Immunantworten des Wirts. Darüber hinaus zeigen wir Viskositätsveränderungen des Wirtsmukus als weiteren immunologischen Interaktionsprozess auf und legen mit ersten Messungen die Grundlage für weiterführende Experimente mit verschiedenen Methoden. In diesem Stadium der Arbeit und basierend auf den ausgewerteten Daten können die Hypothesen und Anforderungen aus 1.6 wie folgt zusammengefasst und beantwortet werden: Es war möglich, die bereits in Mus Musculus etablierte Messmethode (Zweiphotonen-NAD(P)H-FLIM) nicht nur auf Heligmosomoides Polygyrus auszuweiten, sondern beide Spezies gleichzeitig messbar zu machen. Dazu wurden Voruntersuchungen zur Sinnhaftigkeit dieses Ansatzes durchgeführt, insbesondere hinsichtlich der genetischen Eigenschaften des Wurms und des Vorkommens bereits charakterisierter Co-Enzyme. Die Ähnlichkeit des Energie Stoffwechsels und respiratorischer Prozesse des Parasiten konnte somit weitgehend bestätigt werden. Es wurde eine Präparationsmethode für infiziertes murines Darmgewebe für die Zweiphotonen-NAD(P)H-FLIM etabliert, die eine in-vivo-ähnliche Umgebung für den Wurm und das Wirtsgewebe schafft. Dies wurde durch eine optimierte Agarose-Konzentration sowie eine temperaturkontrollierte Umgebung erreicht. Zudem bestätigen verschiedene Langzeitstudien und Vergleiche mit Daten aus lebenden Tieren die Effektivität und Vergleichbarkeit der Präparationspipeline mit lebendem Gewebe. Ein programmgesteuerter Post-Processing-Ansatz wurde entwickelt, der mithilfe bestehender Programme und Erweiterungen des geschriebenen Codes die Segmentierung des aufgenommenen Gewebes ermöglicht. Dadurch können die erfassten Daten standardisiert vergleichbar gemacht sowie durch eine Simplifizierung der Informationsdichte dargestellt werden. Zudem erlaubt dieser Ansatz eine visuelle Aufbereitung der Ergebnisse. Der Fokus liegt dabei auf dem Vorkommen und der Aktivität von Co-Enzymen, den respiratorischen Energie-Stoffwechselwegen und ROS-basierten Abwehrreaktionen. Eine Literaturrecherche zeigt Parallelen zwischen den erhobenen Daten und charakteristischen Krankheitsverläufen auf, insbesondere in Bezug auf ROS-vermittelte Abwehrreaktionen des Wirts und dessen respiratorische Homöostase. Darüber hinaus wurden erstmals die respiratorischen Stoffwechselwege sowie die ROS-vermittelte Abwehr von Heligmosomoides Polygyrus gemessen und analysiert. Die räumlich aufgelöste Messmethode in H.Polygyrus stellt eine Innovation dar und erweitert das Wissen über die metabolischen Wechselwirkungen zwischen Maus und Parasit. Zudem liefert sie neue Erkenntnisse über den Energiebedarf des Wurms, seine Stoffwechselwege und sein Abwehrverhalten während der akuten Infektionsphase.
