Mammalian bones are vital organs with several important functions. In addition to providing structural support and enabling locomotion, bone marrow (BM) is pivotal in nurturing the hematopoietic system, long-term immunological memory, and maintaining mineral and acid-base homeostasis. In regeneration, bone tissue exemplifies scar-free healing ("restitutio ad integrum"). Notwithstanding this potential, many patients still experience impaired fracture healing. This is further exacerbated in an ageing population with coexistent comorbidities, representing a significant clinical and economic burden. Immune cells, particularly myeloid cells, contribute to BM homeostasis and fracture repair. Macrophages, of the myeloid lineage, are involved in all phases of fracture healing. They regulate inflammation and promote angiogenesis by secreting vascular endothelial growth factor (VEGF) and platelet-derived growth factor (PDGF), both essential for successful bone regeneration. Despite macrophages' central role in regeneration, a detailed understanding of their spatio- temporal dynamics and interactions with endothelial cells remains lacking. Given the inherent three-dimensional (3D) tissue architecture, microscopy methods visualizing cellular interactions throughout the bone marrow are crucial. With tissue clearing protocols and modern fluorescence microscopy (e.g., light sheet microscopy), precise 3D imaging of cells in tissue is possible. This thesis presents MarShie, a novel tissue clearing protocol specifically designed to preserve the fragile architecture of BM tissue. It enables unprecedented 3D imaging of entire murine bones, including marrow in a homeostatic state and during fracture healing, using light sheet fluorescence microscopy (LSFM). MarShie safeguards endogenous reporter fluorescence, enables supplementary multicolor immunofluorescent staining, and permits detailed, quantitative spatial analyses of interactions between myeloid cells and vasculature throughout the regenerative cascade. By employing this protocol, we investigated the spatio-temporal dynamics of CX3CR1⁺ myeloid cells and Cdh5⁺ and CD31⁺ vasculature in intramembranous and endochondral fracture healing. Furthermore, we identified intriguing age-related changes, including reduced central sinus volume and increased cortical porosity in aged murine bones, highlighting the impact of aging on vascular remodeling.
Die Knochen von Säugetieren erfüllen essenzielle Funktionen. Neben der strukturellen Unterstützung und Fortbewegung spielt das Knochenmark eine zentrale Rolle bei der Bildung des hämatopoetischen Systems, des immunologischen Langzeitgedächtnisses und der Aufrechterhaltung der Mineral- sowie Säure-Basen-Homöostase. Als Paradebeispiel für narbenfreie Heilung („restitutio ad integrum“) demonstriert das Knochengewebe ein enormes regeneratives Potenzial – wenngleich viele Patient:innen, vor allem in alternden Bevölkerungsgruppen mit Komorbiditäten, weiterhin an einer gestörten Frakturheilung leiden. Dies stellt sowohl klinisch als auch ökonomisch eine erhebliche Belastung dar. Myeloide Zellen, insbesondere Makrophagen, sind für die Homöostase des Knochenmarks und die Frakturheilung von großer Bedeutung. Sie regulieren Entzündungsprozesse und fördern die Angiogenese durch die Sekretion des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) und des aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktors (PDGF), die für eine erfolgreiche Knochenregeneration unerlässlich sind. Trotz ihrer zentralen Rolle fehlt bislang ein detailliertes Verständnis der räumlich-zeitlichen Interaktionen zwischen Makrophagen und Endothelzellen. Aufgrund der inhärenten dreidimensionalen Gewebearchitektur sind fortschrittliche mikroskopische Methoden notwendig, um die zellulären Interaktionen im gesamten Knochenmark abzubilden. Moderne Gewebeklärungsprotokolle und Fluoreszenzmikroskopie, etwa mittels Lichtblattmikroskopie, ermöglichen nun eine präzise 3D-Abbildung von Zellen im Gewebe. Im Rahmen dieser Dissertation wird das neu entwickelte Klärungsprotokoll MarShie vorgestellt, das speziell darauf ausgelegt ist, die fragile Architektur des Knochenmarks zu erhalten. Es erlaubt die subzelluläre 3D-Darstellung ganzer Mäuseknochen im homöostatischen Zustand und während der Frakturheilung, schützt die endogene Reporterfluoreszenz und unterstützt zusätzlich mehrfarbige Immunfluoreszenzfärbungen. So können die Interaktionen zwischen myeloiden Zellen und Gefäßen während der gesamten Regenerationskaskade detailliert und quantitativ analysiert werden. Mit MarShie wurden die räumliche und zeitliche Verteilung von CX3CR1⁺ myeloiden Zellen sowie von Cdh5⁺ und CD31⁺ Endothelzellen bei intramembranöser und endochondraler Frakturheilung untersucht. Zudem ergaben sich bemerkenswerte altersbedingte Veränderungen, etwa eine Reduktion des zentralen Sinusvolumens, eine erhöhte kortikale Porosität und eine Erweiterung des intrakortikalen Knochenmarks in älteren Mäuseknochen. Das vorgestellte Protokoll bietet tiefe Einblicke in die 3D-Organisation der Knochenmarks- Nische und deren Rolle bei der Frakturheilung. Die erzielten Ergebnisse bilden eine Grundlage für die Entwicklung zielgerichteter Therapien zur Verbesserung der gestörten Frakturheilung – insbesondere für alternde Bevölkerungsgruppen, in denen die Knochenregeneration häufig beeinträchtigt ist.
