Biophysical Characterization of Membrane Proteins: External Stimuli as Key Regulators of Ion Channel Activation

Abstract

This dissertation explores novel mechanisms underlying ion channel function and regulation by examining three proteins with distinct external stimuli: the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli, EcMscL, the voltage-gated proton channel from Karlodinium veneficum, KvHv1, and the cation channel channelrhodopsin-1 from Chlamydomonas augustae, CaChR1. Initially, we tested the force-from-lipid gating model for EcMscL by incorporating a photoswitchable lipid into artificial membrane. This strategy enabled modulation of channel activity through light-driven manipulation and therefore providing us with support for the lipid-based gating hypothesis while presenting a novel technique for light-controlled ion channel activation. Additionally, chemical activation of the protein provided information about activation in the absence of mechanical stimuli and the gating model of the system. Furthermore, the structural simplicity of KvHv1, suggests it as a model protein for biophysical studies. Its functional properties and ion selectivity region offers fundamental insights into activation and regulation of voltage-gated proton channels. Mutation studies as well as spectroscopical investigation (in collaborations), shade light to the selectivity filter and its dynamics. Notably, inhibitory studies with the trivalent cation La3+ are suggesting a new model of activation. Finally, this work also presents for the first time the structural characterization of CaChR1 ground state obtained via CryoEM providing further support to previous spectroscopic results with detailed structural analysis. Comparative studies with a structurally homologous channelrhodopsin provided extra information over key amino acid residues governing its photocycle. Collectively, the investigation of EcMscL, KvHv1, and CaChR1 presented here enrich our understanding of ion channel’s function and manipulation, while offering substantial groundwork for future studies aimed at elucidating complex molecular mechanisms of channel activation and regulation.

Diese Arbeit untersucht neuartige Mechanismen, die der Funktion und Regulation von Ionenkanälen zugrunde liegen, anhand von drei Proteinen mit unterschiedlichen externen Stimuli: dem mechanosensitiven Kanal mit hoher Leitfähigkeit aus Escherichia coli (EcMscL), dem spannungsgesteuerten Proton Kanal aus Karlodinium veneficum (KvHv1) und dem Kationenkanal Channelrhodopsin-1 aus Chlamydomonas augustae (CaChR1). Zunächst überprüften wir das „Force-from-Lipid“-Modell für die Aktivierung von EcMscL, indem wir ein photoschaltbares Lipid in eine künstliche Membran integrierten. Diese Strategie ermöglichte die Modulation der Kanalaktivität durch lichtinduzierte Steuerung und lieferte somit Unterstützung für die Lipid-basierte Aktivierungshypothese sowie eine neuartige Methode zur lichtgesteuerten Aktivierung von Ionenkanälen. Zusätzlich ermöglichte die chemische Aktivierung des Proteins Einblicke in die Kanalöffnung in Abwesenheit mechanischer Reize sowie in das zugrunde liegende Aktivierungsmodell. Darüber hinaus legt die strukturelle Einfachheit von KvHv1 nahe, dass es sich um ein geeignetes Modellprotein für biophysikalische Untersuchungen handelt. Seine funktionellen Eigenschaften und die Region der Ionenselektivität liefern grundlegende Erkenntnisse zur Aktivierung und Regulation spannungsgesteuerter Protonenkanäle. Mutationsstudien sowie spektroskopische Untersuchungen (in Zusammenarbeit mit Partnern) warfen neues Licht auf den Selektivitätsfilter und dessen Dynamik. Besonders hervorzuheben sind Inhibitionsstudien mit dem dreiwertigen Kation La³⁺, die auf ein neues Modell der Kanalaktivierung hindeuten. Abschließend präsentiert diese Arbeit erstmals die strukturelle Charakterisierung des Grundzustands von CaChR1 mittels Kryo-EM und liefert damit durch die detaillierte Strukturanalyse Bestätigung für frühere spektroskopische Ergebnisse. Vergleichende Studien mit einem strukturell homologen Channelrhodopsin lieferten zusätzliche Informationen über Schlüsselasparagine, die den Photozyklus steuern. Zusammenfassend vertiefen die hier vorgestellten Untersuchungen zu EcMscL, KvHv1 und CaChR1 unser Verständnis der Ionenkanalbiologie und bieten eine solide Grundlage für zukünftige Studien zur Aufklärung komplexer molekularer Mechanismen der Kanalaktivierung und -regulation.