The synthesis of ribosomes is one of the major tasks in actively growing bacteria, where ribosomes can make up as much as 30% of the cellular dry mass. Therefore, diverse strategies are needed to regulate the synthesis of ribosomal proteins (r-proteins) and RNAs (rRNAs) to prevent energy waste during cell growth. Expression of the E. coli rpsJ operon, which encodes 11 r-proteins, is autogenously regulated by one of its products, r-protein L4. L4 is unique as it is the only E. coli r-protein that mediates autogenous control through transcriptional attenuation. An RNA element encoded by the operon’s leader region is involved in this attenuation process. The RNA can form five hairpin structures, HA to HE, followed by two attenuation sites, ATT and ATT’. L4 attenuates rpsJ transcription by stalling RNA polymerase at ATT and ATT’ sites, a process which is strictly dependent on NusA. To understand this regulatory event at a molecular level, single-particle cryogenic electron microscopy (cryo-EM) was used to determine the structures of E. coli transcription attenuation complexes (ATTCs) in the absence and presence of transcription factors, including NusA, L4, and the universal transcription factor NusG. These structures reveal hairpin-dependent stabilization of the paused transcription complex by NusA and L4, as well as the involvement of the NusA KH1 domain and the RNA polymerase (RNAP) β’ subunit in L4 binding. NusA contributes to transcription pausing by stabilizing the RNA hairpin HE at the RNA exit channel. An additional hairpin HD, sandwiched between L4 and NusA KH1-KH2 domains, is incorporated into the ATTC when L4 binds to the complex. In vitro transcription assays using a NusA variant that lacks the KH1-KH2 domains confirmed the importance of the NusA KH1-KH2 domains in the rpsJ attenuation process. Furthermore, the roles of L4 and its interactions with hairpin HD and RNAP were demonstrated through site-directed mutagenesis of L4 and RNAP, combined with in vitro transcription assays. E. coli has also evolved a transcription anti-termination complex (rrnTAC) to efficiently synthesize rRNAs. In rrnTACs, RNAP is modified at the RNA exit channel by a complex RNA chaperone composed of the transcription factors NusA, NusB, NusG, S10, and SuhB. This multi-factor RNA chaperone facilitates the co-transcriptional folding of nascent rRNA, which is a prerequisite for subsequent processing of the primary transcript into mature rRNAs. The first step in rRNA maturation is cleavage by RNase III. Upon completion of 16S rRNA transcription, a long, double-stranded RNA (dsRNA) stem (16S stem) is formed. This stem contains the recognition motif for RNase III cleavage, which generates the pre-16S rRNA. To investigate the molecular basis of co-transcriptional rRNA folding and processing, cryo-EM was used to determine structures of rrnTACs containing variants of the 16S stem that include the RNase III cleavage motif and resemble the pre-processed transcript of pre-16S RNA. NusA and the SuhB dimer anchor the 5’ end of the 16S stem near the RNA exit channel, creating a platform for dsRNA formation in a spatially defined region. Structures of rrnTACs bound by an inactive RNase III variant were also elucidated. The dimeric RNase III engages the 16S stem on the side opposite the RNAP-associated RNA chaperone and forms direct contacts not only with the dsRNA but also with NusA and one of the SuhB subunits. These findings reveal the structural basis of co-transcriptional, long-range RNA secondary structure formation by tethering the 5’ part of the nascent RNA to a multi-factor RNA chaperone, bringing it into proximity with the emerging 3’ part to promote dsRNA formation. Together, these molecular insights into ATTCs and rrnTACs provide a better understanding of the regulatory mechanisms governing ribosome synthesis during rapid bacterial growth and may inform the development of antibiotics targeting the bacterial ribosome synthesis pathway.
Die Synthese von Ribosomen ist eine der Hauptaufgaben in aktiv wachsenden Bakterien, wobei Ribosomen bis zu 30 % der zellulären Trockensubstanz ausmachen können. Daher sind vielfältige Strategien erforderlich, um die Synthese von ribosomalen Proteinen (r-Proteinen) und RNAs (rRNAs) zu regulieren und Energieverschwendung während des Zellwachstums zu vermeiden. Die Expression des rpsJ-Operons von E. coli, das für 11 r-Proteine codiert, wird autogen durch eines seiner Produkte, das r-Protein L4, reguliert. L4 ist insofern einzigartig, als es das einzige r-Protein von E. coli ist, das autogene Kontrolle durch transkriptionelle Attenuation vermittelt. Ein RNA-Element, das von der Leader-Region des Operons codiert wird, ist an diesem Attenuationsprozess beteiligt. Die RNA kann fünf Haarnadelstrukturen (Hairpins) ausbilden, HA bis HE, gefolgt von zwei Attenuationsstellen, ATT und ATT’. L4 attenuiert die Transkription des rpsJ-Operons, indem es eine vorzeitige Termination an diesen spezifischen Stellen induziert – ein Prozess, der strikt von NusA abhängig ist. Um diesen Regulationsmechanismus auf molekularer Ebene zu verstehen, wurde Einzelpartikel-Kryoelektronenmikroskopie (cryo-EM) eingesetzt, um die Strukturen von Transkriptions-Attenuationskomplexen (ATTCs) von E. coli in Abwesenheit und Anwesenheit von Transkriptionsfaktoren – darunter NusA, L4 und der universelle Transkriptionsfaktor NusG – zu bestimmen. Diese Strukturen zeigen eine hairpin-abhängige Stabilisierung des pausierenden Transkriptionskomplexes durch NusA und L4 sowie die Beteiligung der NusA-KH1-Domäne und der RNAP-β’-Untereinheit an der Bindung von L4. NusA trägt zur Transkriptionspause bei, indem es die RNA-Haarnadel HE am RNA-Austrittskanal stabilisiert. Eine zusätzliche Haarnadelstruktur, HD, die zwischen L4 und den NusA-KH1-KH2-Domänen eingeschlossen ist, wird in den ATTC eingebaut, wenn L4 an den Komplex bindet. In-vitro-Transkriptionsassays mit einer NusA Variante, bei der die KH1-KH2 Domänen entfernt wurden, bestätigten die Bedeutung der NusA-KH1-KH2-Domänen im rpsJ-Attenuationsprozess. Darüber hinaus wurden die Rollen von L4 sowie dessen Interaktionen mit Hairpin HD und RNAP durch ortsgerichtete Mutagenese von L4 und RNAP in Kombination mit In-vitro-Transkriptionsassays aufgezeigt. E. coli hat außerdem einen Transkriptions-Antiterminationskomplex (rrnTAC) entwickelt, um rRNAs effizient zu synthetisieren. In rrnTACs wird die RNAP am RNA-Austrittskanal durch ein komplexes RNA-Chaperon modifiziert, das aus den Transkriptionsfaktoren NusA, NusB, NusG, S10 und SuhB besteht. Dieses multifaktorielle RNA-Chaperon erleichtert die co-transkriptionelle Faltung der naszierenden rRNA, was eine Voraussetzung für die anschließende Prozessierung des Primärtranskripts zu reifen rRNAs ist. Der erste Schritt der rRNA-Maturation ist die Spaltung durch RNase III. Nach Abschluss der Transkription der 16S-rRNA bildet sich ein langer, doppelsträngiger RNA-Stamm (16S-Stamm). Dieser enthält das Erkennungsmotiv für die RNase-III-Spaltung, durch die die prä-16S-rRNA entsteht. Um die molekulare Grundlage der co-transkriptionellen rRNA-Faltung und -Prozessierung zu untersuchen, wurde cryo-EM eingesetzt, um die Strukturen von rrnTACs mit Varianten des 16S-Stamms zu bestimmen, die das RNase-III-Spaltungsmotiv enthalten und dem vorprozessierten Transkript der prä-16S-rRNA ähneln. NusA und ein SuhB-Dimer verankern das 5’-Ende des 16S-Stamms in der Nähe des RNA-Austrittskanals und schaffen so eine Plattform für die dsRNA-Bildung in einem räumlich definierten Bereich. Darüber hinaus wurden Strukturen von rrnTACs, die mit einer inaktiven Variante von RNase III gebunden sind, aufgeklärt. RNase III bindet den 16S-Stamm auf der dem RNAP-assoziierten RNA-Chaperon gegenüberliegenden Seite als Dimer und bildet direkte Kontakte nicht nur mit der dsRNA, sondern auch mit NusA und einer der SuhB-Untereinheiten. Diese Ergebnisse zeigen die strukturelle Grundlage der co-transkriptionellen Ausbildung von RNA-Sekundärstrukturen über lange Distanzen auf, indem das 5’-Ende der naszierenden RNA an ein multifaktorielles RNA-Chaperon gebunden und dadurch in die Nähe des entstehenden 3’-Endes gebracht wird, um die dsRNA-Bildung zu fördern. Gemeinsam liefern diese molekularen Einblicke in ATTCs und rrnTACs ein besseres Verständnis der Regulationsmechanismen, die die Ribosomsynthese während des schnellen bakteriellen Wachstums steuern, und könnten zur Entwicklung von Antibiotika beitragen, die auf den Syntheseweg bakterieller Ribosomen abzielen.
