This dissertation explores the development of a novel three-dimensional (3D) bone marrow (BM) culture system, marking a significant advancement in the ex vivo survival of human plasma cells (PCs). By employing primary femoral BM tissue and a collagen-hyaluronic acid (Col-HA) hydrogel, this study established a more physiologically relevant environment than traditional cell culture models. A specifically designed Col-HA hydrogel, which reproduces some BM biomechanical properties, was the essential method implemented to preserve primary tissue integrity in vitro. Together with a PCs-tailored culture medium, our investigation demonstrated the obtained 3D BM culture system’s ability to sustain key survival factors and replicate the complex BM microenvironment, thus supporting the long-term viability and antibody production of PCs, which is crucial for studying haematological conditions and developing new treatments. The additional integration of a dynamic microphysiological system (MPS) aimed to further explore a more realistic simulation of the BM niche, providing valuable insights into cell behaviour and interactions within the hydrogel matrix. The present work also highlights the potential for future advancements in the outlined 3D BM model. Ongoing and upcoming research will focus on further optimizing the system through vascularization, which is critical for nutrient supply and waste removal, thereby enhancing cell survival and function. Single-cell analyses, such as scRNA CITE-seq, will be essential for detailed profiling of the in-tissue composition, marker expression, and interactions of different cell subpopulations. These analyses will provide deeper insights into the BM microenvironment’s complexity and inform the development of advanced therapeutic strategies. One of the significant aims of this study was the establishment of a testing platform to integrate chimeric antigen receptor (CAR) T cells into the 3D BM model. To this end, a collaborative project presented here achieved efficient and safe generation of CAR T cells via CRISPR-Cas9, offering a promising alternative to traditional viral transduction methods. TRAC locus insertion of CAR transgenes into T cells might pave the way for the creation of an effective therapeutic off-the-shelf strategy. Preliminary observations indicate that TRAC-replaced CAR T cells interact effectively with the Col-HA hydrogel in a 3D conformation. In conclusion, this work underscores the potential of the 3D BM culture system in advancing our understanding of BM biology and improving the development of targeted therapies, such as CAR T cell treatments. By connecting in vitro models with in vivo conditions, this research lays the foundation for more precise and efficient therapeutic approaches, with the ultimate goal of advancing clinical applications and enhancing patient outcomes.
Diese Dissertation untersucht die Entwicklung eines neuartigen dreidimensionalen (3D) Knochenmark (BM) Kultursystems, das einen bedeutenden Fortschritt für die ex-vivo Kultivierung und das überleben humaner Plasmazellen (PCs) darstellt. Durch die Verwendung von primärem femoralem BM-Gewebe und einem Kollagen-Hyaluronsäure (ColHA) Hydrogel zeigt diese Studie erstmalig ein physiologisch relevanteres System im Vergleich zu konventionellen Zellkulturen. Um die Gewebeintegrität in vitro zu erhalten, wurde ein speziell entwickeltes Col-HA-Hydrogel eingesetzt, dass die biomechanischen Eigenschaften des BM nachbilden. Unsere Studie demonstriert, dass im 3D-BM-Modell-Modell wichtige Faktoren der BM-Mikronische für das überleben der PCs teilweise nachgebildet werden. Zudem wurde ein speziell auf PCs abgestimmtes Kulturmedium verwendet. Das Langzeitüberleben und die Antikörperproduktion der PCs sind entscheidend für die Analyse hämatologischer Erkrankungen und die Entwicklung neuer Therapien. Das System wurde zudem unter dynamischen mikrophysiologischen Kulturbedingungen (MPS) getestet, um eine physiologischere Simulation der BM-Mikronische zu erforschen. Die Arbeit betont auch das Potenzial des Modells für zukünftige Anwendungen und weist auf wichtige Aspekte zur Weiterentwicklung hin. Laufende und künftige Forschung konzentriert sich auf die Vaskularisierung, um die Nährstoffversorgung und Abfallbeseitigung der Zellen zu optimieren. Einzelzellanalysen wie scRNA CITE-seq sind unerlässlich, um ein detaillierteres Verständnis der Gewebszusammensetzung, Marker Expression, Funktionalität und Interaktionen verschiedener Zellpopulationen zu gewinnen. Diese Analysen werden tiefere Einblicke in die Komplexität des BM-Mikroenviroments liefern und die Entwicklung neuer Therapiestrategien vorantreiben. Ein zentrales Ziel dieser Studie war die Etablierung einer Testplattform zur Integration von chimerischen Antigenrezeptor (CAR) T Zellen in das 3D-BM-Modell. Die vorgestellte Generierung von CAR T Zellen mittels CRISPR-Cas9 Geneditierung, die im Rahmen ei nes Koorperationsprojekts durchgef¸hrt wurde, bietet eine vielversprechende Alternative zur konventionellen viralen Transduktion. Die Integration von CAR-Transgenen in den TRAC-Locus von T Zellen, repräsentiert eine effektive Strategie für die Herstellung therapeutisch relevanter Off-the-shelf Produkten. Erste Beobachtungen zeigen, dass TRAC CAR T Zellen funktional in dem 3D System interagieren. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit das Potenzial des 3D-BM-Kultursystems, um das Verständnis der Knochenmarksbiologie zu erweitern und die Entwicklung gezielter Therapien, wie z.B. CAR T-Zell-Behandlungen, zu fördern. Diese Plattform kann helfen, die Kluft zwischen in vitro und in vivo Modellen zu überbrücken und die klinische Translation zu beschleunigen, um Patientenbehandlungen zu verbessern.
