In the light of rising cancer rates, the development of more effective and specific cancer therapies is essential. Protein microparticles (MPs) as drug delivery vehicles have shown many advantages such as biodegradability, non-immunogenicity and biocompatibility. They have the potential to solve common limitations in the application of anticancer drugs including poor water solubility, dose-limiting toxicity, poor targeting and anticancer drug resistance. The hemoglobin-MPs (HbMPs) were prepared using a newly developed Coprecipitation-Crosslinking-Dissolution (CCD) and one-pot method. Different approaches to improve cell targeting of the MPs, including Layer-by-Layer assembly with the oppositely charged polyelectrolytes alginate, polyethyleneimine (PEI) and human serum albumin (HSA) and functionalization with active C-end rule (CendR) peptides (P-OH) and control peptides (P-NH2) were investigated. CendR peptides bind to the NRP-1 receptor, which is overexpressed by most solid tumors. Cellular uptake was evaluated by FACS measurement and CLSM, and the metabolic effect of the MPs on the cells was assessed by CCK-8 assay. In additional experiments, the one-pot MPs were loaded with the chemotherapeutic agent doxorubicin (DOX). In NRP-1 positive PPC1 cells, LbL-assembly increased the percentage of cells with internalized HbMPs after 24h to more than 90%, compared to uncoated HbMPs which were internalized by less than 10% of cells. Additional functionalization with CendR peptides did not further increase the uptake. In NRP-1 negative M21 cells, uncoated HbMPs were taken up by 22% of the cells and LbL-coated HbMPs were taken up by about 64% of the cells after 24h. When functionalized with peptides, P-LbL-HbMPs were found in more than 90% of the M21 cells after 24h. Pre-incubation of both cell lines with Anti-NRP-1 antibodies did not influence the uptake of the MPs. None of the evaluated MPs affected cell viability or metabolic activity. Using the one-pot fabrication method, a DOX drug-loading efficiency of 77% was achieved. The increased endocytosis of MPs by the investigated cells, achieved through surface modification of the MPs, represents an important step in the development of protein MPs as drug carriers. Further experiments are necessary to confirm or refute the hypothetical mechanisms that led to the enhanced uptake of P-LbL-HbMPs in NRP-1 negative M21 cells as a result of the LbL coating.
Weltweit steigende Krebsraten erfordern die Entwicklung wirksamerer und zielgerichteterer Tumortherapien. Die derzeit verfügbaren Therapieoptionen weisen zahlreiche Einschränkungen auf, wie z.B. schlechte Wasserlöslichkeit der Medikamente, dosislimitierende Toxizität, unzureichendes Zelltargeting und Arzneimittelresistenz. Die Entwicklung von Protein-Mikropartikeln (MP) als Wirkstoffträger stellt eine vielversprechende Alternative zur Überwindung dieser Herausforderungen dar. Im Vergleich zu vielen anderen Wirkstoffträgern sind Protein-MP biokompatibel, biologisch abbaubar und nicht immunogen. Die hier verwendeten Hämoglobin-MP (HbMP) wurden nach der neu entwickelten Coprecipitation-Crosslinking-Dissolution (CCD) und One-Pot Methode hergestellt. Verschiedene Methoden zur Verbesserung des Zelltargetings wurden untersucht, wie z.B. die Layer-by-Layer (LbL) Beschichtung mit den entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten Alginat, Polyethylenimin (PEI) und Humanes Serum Albumin (HSA) und die Funktionalisierung mit aktiven C-end rule (CendR) Peptiden. CendR-Peptide binden an den NRP-1-Rezeptor, der von vielen Tumorzellen überexprimiert wird. Die Aufnahme der MP wurde an NRP-1 positiven PPC1 Zellen und NRP-1 negativen M21 Zellen mittels FACS Messungen und CLSM untersucht und die metabolischen Effekte auf die Zellen mit dem CCK-8 Test bestimmt. In weiteren Experimenten wurden die One-Pot MP mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin (DOX) beladen. In PPC1 Zellen führte die LbL-Beschichtung der HbMP nach 24h zu einer Aufnahme in mehr als 90 % der Zellen, während unbeschichtete HbMP von weniger als 10% der Zellen aufgenommen wurden. Eine weitere Funktionalisierung der LbL-HbMP mit CendR-Peptiden führte zu keiner weiteren Steigerung der Aufnahme. In den M21 Zellen waren nach 24h durchschnittlich 64% der Zellen mit LbL-HbMP beladen, während die mit Peptiden funktionalisierten P-LbL-HbMP von mehr als 90% der Zellen aufgenommen wurden. Die Vorinkubation mit Anti-NRP-1 Antikörpern zeigte in beiden Zelllinien keine Auswirkung auf die Aufnahme der MP. Zudem beeinflusste keiner der untersuchten MP die Zellviabilität. Zusätzlich zu den Zellversuchen konnte mit der One-Pot-Methode eine DOX-Einschlusseffizienz von circa 77% erreicht werden. Die durch die Oberflächenmodifikation der MP erreichte Steigerung der Endozytose der MP durch die untersuchten Zellen stellt einen wichtigen Schritt in der Entwicklung von Protein-MP als Medikamententransporter dar. Weiterführende Versuche sind notwendig, um die hypothetischen Mechanismen, die zur verstärkten Aufnahme von P-LbL-HbMP in NRP-1 negativen M21 Zellen infolge der LbL-Beschichtung führten, zu bestätigen oder zu widerlegen.
