Microbial rhodopsins and phytochromes are photoreceptors that use light to trigger biochemical processes. Upon light activation, they undergo a cyclic cascade of reactions leading to substrate transfer and/or conformational changes associated with the chromophore and protein. NmHR and UmRh1, two microbial rhodopsins, are a bacterial inward chloride pump and a fungal outward proton pump, respectively. While the role of NmHR from a marine bacterium is similar to that of the well-known archaeal inward chloride pump halorhodopsins (HsHR and NpHR), it shares a higher sequence homology with the bacterial outward sodium pump KR2. In addition, each rhodopsin contains a three-residue motif composed of amino acids involved in substrate transfer. The NTQ motif of NmHR is quite conserved in the sodium pump KR2 (NDQ), but is represented by a neutral TSA motif in archaebacterial halorhodopsins, suggesting a divergent evolution. A comprehensive mutational and spectroscopic analysis of residues known to be important for chloride transfer in archaeal halorhodopsins and for sodium transfer in KR2 revealed that chloride release and uptake in NmHR is different from that of archaeal halorhodopsins, but the architecture and residues involved in the process are more similar to KR2, despite the different charge and orientation of the transported ion. UmRh1 is a rhodopsin found in the pathogenic fungus Ustilago maydis, which causes corn smut disease. This fungal rhodopsin shares a high sequence similarity with the well-known archaeal outward proton pump bacteriorhodopsin (HsBR), especially at residues known to be important for the proton pathway of the latter. The DTD motif of HsBR is conserved in UmRh1 and is represented by a DTE motif. However, extensive mutagenesis and spectroscopy revealed that the protonation dynamics of UmRh1 are slightly different from those of HsBR, especially in the proton uptake reaction. Furthermore, the pump activity of UmRh1 is enhanced in the presence of auxins such as IAA (indole-3-acetic acid). Using time-resolved spectroscopy on UmRh1 variants in the presence and absence of IAA, a potential role for auxin was elucidated. It is involved in the enhancement of the reprotonation mechanism and the proton release reaction associated with its pathogenic role. Another aspect that has intrigued scientists over the years is the link between light and chromophore isomerization in photoreceptors, which leads to conformational changes in the protein. How does the signal propagate in the early stages of the photocycle after photon absorption? By introducing the noncanonical amino acid p-cyano-phenylalanine in NmHR and the phytochrome Agp2 into positions of conserved tryptophan residues known to be involved in conformational changes around the chromophore, preliminary results have been obtained that shed light on the protein-chromophore interaction.
Mikrobielle Rhodopsine und Phytochrome sind Photorezeptoren, die Licht nutzen, um biochemische Prozesse auszulösen. Nach der Aktivierung durch Licht durchlaufen sie eine zyklische Reaktionskaskade, die zu einem Substrattransfer und/oder Konformationsänderungen im Zusammenhang mit dem Chromophor und dem Protein führt. Die hier untersuchten zwei mikrobiellen Rhodopsine sind NmHR, eine bakterielle nach innen gerichtete Chloridpumpe, und UmRh1, eine nach außen gerichtete pilzliche Protonenpumpe. Während die Rolle des aus einem Meeresbakterium stammenden NmHR derjenigen der bekannten Halorhodopsine (HsHR und NpHR) aus Archaeen ähnelt, weist es eine größere Sequenzhomologie mit der bakteriellen Natrium-Auswärtspumpe KR2 auf. Darüber hinaus enthält jedes Rhodopsin ein aus drei Aminosäuren bestehtes Motiv auf, das am Substrattransfer beteiligt ist. Das NTQ-Motiv von NmHR ist in der Natriumpumpe KR2 (NDQ) weitgehend konserviert, wird aber in archaebakteriellen Halorhodopsinen durch ein neutrales TSA-Motiv repräsentiert, was auf eine divergente Evolution hindeutet. Eine umfassende Mutationsanalyse mit nachfolgender spektroskopischer Untersuchung von Aminosäureresten, die für den Chlorid-Transfer in archaealen Halorhodopsinen und für den Natrium-Transfer in KR2 bekannt sind, ergab, dass sich in NmHR die Chloridfreisetzung und Aufnahme von der in archaealen Halorhodopsinen unterscheidet, dass aber die Architektur und die an dem Prozess beteiligten Aminosäuren dem KR2 ähnlicher sind, trotz der unterschiedlichen Ladung und Ausrichtung des transportierten Ions. UmRh1 ist ein Rhodopsin, welches in dem pathogenen Pilz Ustilago maydis vorkommt, der die Maisfleckenkrankheit verursacht. Dieses Pilzrhodopsin weist eine hohe Sequenzähnlichkeit mit der bekannten aus Archaeen stammenden Protonenpumpe Bakteriorhodopsin (HsBR) auf, vor allem an Stellen, die für den Protonenweg der letzteren wichtig sind. Das DTD-Motiv von HsBR ist in UmRh1 konserviert und wird durch ein DTE-Motiv dargestellt. Ausführliche Mutagenese und Spektroskopie zeigten jedoch, dass sich die Protonierungsdynamik von UmRh1 geringfügig von derjenigen von HsBR unterscheidet, insbesondere bei der Protonenaufnahmereaktion. Außerdem ist die Pumpaktivität von UmRh1 in Gegenwart von Auxinen wie IAA (Indol-3-Essigsäure) verstärkt. Durch zeitaufgelöste Spektroskopie an UmRh1-Varianten in Gegenwart und Abwesenheit von IAA wurde eine mögliche Rolle von Auxin aufgedeckt. Es ist wahrscheinlich an der Verstärkung des Reprotonierungsmechanismus und der Protonenfreisetzungsreaktion im Zusammenhang mit seiner pathogenen Rolle beteiligt. Ein weiterer Aspekt, der die Wissenschaftler im Laufe der Jahre fasziniert hat, ist die Verbindung zwischen Licht und der Isomerisierung des Chromophors in den Photorezeptoren, die zu Konformationsänderungen des Proteins führt. Wie wird das Signal in den frühen Stadien des Photozyklus nach der Photonenabsorption weitergeleitet? Durch die Einführung der nicht-kanonischen Aminosäure p-Cyano-Phenylalanin in NmHR und in Phytochrom Agp2 in Positionen von konservierten Tryptophanresten, von denen bekannt ist, dass sie an Konformationsänderungen um das Chromophor herum beteiligt sind, wurden erste Ergebnisse erzielt, die Licht auf die Protein-Chromophor-Interaktion werfen.
