Macrophages represent an integral part of the innate immune system, serving diverse purposes not only in maintaining homeostasis but also during response to pathogens or tissue injury. Capable of modifying versatile cell features, macrophages can dynamically adapt to their surroundings. Next to soluble cues, such as bacterial components and cytokines, the cellular microenvironment includes physical properties, which can be detected by mechanosensitive ion channels. In the gut, unique niche characteristics enable myeloid cells to extend protrusions through the epithelial barrier and receive stimuli from the luminal side. Here, lamina propria macrophages can encounter the ubiquitous protozoan Giardia, which causes one of the most common parasitic infections worldwide and leads to diarrheal disease. At its trophozoite stage, the parasite uses a specialized disc to adhere to the intestinal wall by suction-based forces. The aim of my dissertation was to investigate how mechanical stimulation could influence myeloid cells in this context, using murine macrophages in well-controlled experiments in vitro. Due to its importance in mechanosensation, the work focused on the cation channel PIEZO1. As calcium ions (Ca2+) inhabit a pivotal role in regulating essential cell functions including inflammatory activation, cytoplasmic Ca2+ dynamics were examined using genetically encoded calcium sensors. To quantify the influence of chemical PIEZO1 stimulation on cell fate decision and intracellular Ca2+ levels, flow cytometry and multiphoton imaging protocols were devised. Incubation with PIEZO1 agonist Yoda1 or antagonist Dooku1 did not substantially alter the expression of macrophage phenotype markers. However, cells activated with LPS+IFN-γ or IL-4 exhibited increased Ca2+ baselines and reactivity to PIEZO1 activation, indicating enhanced sensitivity to mechanical signals. To differentiate complex metabolic features in distinct conditions, methods for label-free fluorescence lifetime imaging of NAD(P)H were implemented. Exposing macrophage monolayers to G. muris allowed for probing natural mechanostimulation. Notably, Ca2+ influx was triggered by living, actively moving parasites, contrasting heat-inactivated, floating parasites. The dependency of this stimulatory potential on trophozoite viability suggests that an active contribution, such as attachment, is required for elevating intracellular Ca2+ levels. As the Ca2+ influx resembles effects of Yoda1, PIEZO1-mediated mechanosensing could indeed be relevant in this scenario. The findings of my thesis highlight the role of mechanosensation in immune reactions. The developed experimental setup is transferrable to intravital imaging and thus might pave the way for advanced analysis of Ca2+ signaling in whole organ systems. An improved understanding of connections between macrophage plasticity and tissue mechanics in mucosal responses, possibly in inflammatory bowel disease, may inspire future treatment strategies.
Makrophagen (MP) sind ein wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems und übernehmen Aufgaben wie Aufrechterhaltung der Homöostase oder Reaktion auf Pathogene und Gewebeverletzung. Durch Modifikation vielfältiger Eigenschaften können MP sich an ihre Mikroumgebung anpassen. Zu letzterer gehören neben bakteriellen Bestandteilen und Zytokinen auch physikalische Merkmale, die von mechanosensitiven Ionenkanälen detektiert werden. Die einzigartige Darmanatomie ermöglicht MP, mittels Zellfortsätzen durch das Epithelium zu reichen und somit luminale Reize wahrzunehmen. Solch ein Stimulus könnten Giardien sein, welche als weltweit verbreitete Durchfallerreger bekannt sind. Als Trophozoiten können sich diese Parasiten mittels Haftscheiben an die Darmwand ansaugen. Das Ziel der Dissertation war es, in diesem Kontext den Einfluss mechanischer Stimulation auf myeloide Zellen zu untersuchen. Dabei wurden murine MP in kontrollierten in-vitro- Versuchen verwendet. Aufgrund seiner Bedeutung in der Mechanosensorik konzentrierte sich meine Arbeit auf den Kationenkanal PIEZO1. Calciumionen (Ca2+) spielen eine zentrale Rolle bei der Regulierung wesentlicher zellulärer Prozesse. Deshalb wurden zytoplasmatische Ca2+-Dynamiken mittels genetisch kodierter Sensoren untersucht. Um die Auswirkung chemischer PIEZO1-Modulation auf Zellfunktion und intrazelluläres Ca2+ zu quantifizieren, wurden Protokolle für Durchflusszytometrie und Multiphotonenmikroskopie entworfen. Inkubation der Zellen mit PIEZO1-Agonist Yoda1 oder Antagonist Dooku1 veränderte die Expression von Phänotyp-Markern unwesentlich. Mit LPS+IFN-γ oder IL-4 stimulierte MP zeigten jedoch erhöhte Ca2+-Werte unter Ruhebedingungen sowie gesteigerte Reaktionsfähigkeit bei PIEZO1-Aktivierung. Dies deutet auf erhöhte Sensibilität gegenüber mechanischen Signalen hin. Zur weiteren Differenzierung komplexer Stoffwechselprozesse wurde Fluoreszenzlebensdauer-Messung von NAD(P)H implementiert. Die Exposition von MP gegenüber G. muris wurde zur Untersuchung natürlicher mechanischer Kräfte genutzt. Interessanterweise verursachten lebendige Parasiten im Gegensatz zur hitzeinaktivierten Kontrolle einen Ca2+-Einstrom. Diese Abhängigkeit des Aktivierungspotenzials von der Beweglichkeit und Vitalität der Trophozoiten legt nahe, dass ein aktiver Beitrag (z.B. Adhäsion) erforderlich sein könnte, um den Ca2+-Spiegel zu erhöhen. Da die Daten den Effekten von Yoda1 ähneln, könnte PIEZO1-vermittelte Mechanosensorik tatsächlich auch in diesem Szenario relevant sein. Diese Erkenntnisse heben die Bedeutung von Mechanosensorik in Immunreaktionen hervor. Der entwickelte experimentelle Ansatz ist auf Intravitalmikroskopie anwendbar und könnte somit präzise Analysen von Ca2+-Signalübertragung in ganzen Organen ermöglichen. Ein verbessertes Verständnis der Zusammenhänge zwischen MP-Plastizität und Gewebemechanik in mukosalen Vorgängen (u.a. bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen) könnte zukünftige Behandlungsstrategien inspirieren.
