In this research, my focus has been on reducing the knowledge gap between secondary metabolism, distribution of compounds in plants, localization of endophytes directly on-tissue and metabolic re-programming of microorganisms. Four different approaches were used to reach this goal. Initially, the distribution of endogenous alkaloids in Conium maculatum was examined through on-tissue derivatization and Mass Spectrometry Imaging (MSI). Coniferyl aldehyde was discovered to be a reliable and practical derivatized agent in hemlock alkaloid detection. These alkaloids, with low molecular weight, were detected in the leaves, roots, stem, and fruit of the plant by Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI-MSI). With this methodology, it was possible to detect the two most well-known hemlock alkaloids and some additional alkaloids that have been described as tentative constituents of the plant. Also, the key amino acid alanine in the alkaloid biosynthesis was revealed, and the localization of isomeric alkaloids was determined. Furthermore, the distribution of alkaloids in germinated and non-germinated fruits was studied, showing a relocalization of alkaloids in germinated fruits. These results could be used to discuss how the plant uses metabolites to protect its next generation. Finally, a potential new alkaloid was detected and analyzed using MSI, MS, and MS/MS (tandem mass spectrometry). Second, a novel endophyte fungus from Aster tataricus, and new azaphilone compounds were isolated from this endophyte. Besides, the anticancer activity of one of the new compounds was found. The plant A. tataricus has been used for more than 2000 years in traditional Chinese medicine. Recently, an endophyte from this plant demonstrated the ability to produce the most well-known compounds in the plant, exposing the high chemical potentiality of their fungal endophytes to produce cytotoxic agents. Based on these findings, endophytes were isolated, and their extracts were preliminary screened with HeLa cells and Caenorhabditis elegans to evaluate their cytotoxic activity. Followed by the analysis of extract chemical compositions by MS molecular networking and dereplication. Additionally, a morphological inspection of the fungi was performed. The known strains were discarded from this study. This strategy allowed us to isolate a new fungal strain, Tengochaeta bulbillosa, as well as five unreported azaphilones (bulbillosin A—E). Bulbillosin A was characterized by the NCI-60 Human Tumor Cell Lines Screen, which found high tumor cell specificity. Finally, the localization of the isolated compounds was evaluated on plant tissues by MSI, suggesting that the fungus is present on the complete plant or their bulbillosins are transported from roots to leaves through the plant. Third, the localization of astins in Aster tataricus and the colocalization of these compounds with Cyanodermella asteris in the plant were analyzed. A. tataricus is known for containing cytotoxic chlorine- and allo-Thr-containing cyclic pentapeptides, called astins. Structurally, these compounds differ in the presence of acetylated substituents, chlorine atoms, or the exchange of some amino acids in the cycle. However, one of the most interesting findings was that C. asteris, an endophytic fungus from A. tataricus, can produce the astins C, F, and G, only reported as constituent of the plant. This intriguing result prompted us to investigate further the location of the astins directly in plant tissues. MSI was used for the localization of astins, revealing non-homogeneous distribution on the different tissues. Additionally, to complement this study, the C. asteris strain was cultivated in media supplemented with NaCl, and the composition of the cultivation media plus fungus hyphae extracts was evaluated by MS molecular networking. The comparison showed the presence of astins C, F/M, and G in the non-supplemented and supplemented media (as was found before), but also other known and unknown astins were detected in the presence of salt. This result reinforces the idea that the endophyte is the only organism producing the compounds within the plant due to the fungus needs specific conditions to produce diverse astins. Finally, the composition of extracts from solo- and co-cultivation of Bacillus amyloliquefaciens and Colletotrichum graminicola was studied. C. graminicola—B. amyloliquefaciens confrontation test suggested metabolic re-programming due to the observation of hyphae swelling, color changes, and growth arrested in fungus hyphae. Investigations indicate that growing strains in laboratory conditions often silence valuable bioactive compound biosynthesis; however, it could be reactivated in confrontation experiments. The analysis of microbial metabolism in the co-cultivation test showed the presence of ninety-six ions belonging to nitrogen compounds, which are not produced in solo-cultivation. These results suggested the enormous metabolic plasticity in confrontation experiments. In conclusion, a new species of endophytic fungus was identified, five unreported azaphilones were elucidated, and a possible new hemlock alkaloid was detected. The MSI images gave a deeper understanding of the localization of exogenous and endogenous compounds in plants and the potential relationship with their environment. Regarding possible applications of the compounds studied, the complete anticancer characterization of the major bulbillosin was reported, as was the potential use of B. amyloliquefaciens to control C. graminicola.
In dieser Dissertationsarbeit wurde sich darauf konzentriert, die Wissenslücke zwischen Sekundärstoffwechsel, Verteilung von Verbindungen in Pflanzen, Lokalisierung von Endophyten direkt auf dem Gewebe und metabolischer Neuprogrammierung von Mikroorganismen zu schließen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden vier verschiedene Vorgehensweisen verwendet. Zunächst wurde die Verteilung der endogenen Alkaloide in Conium maculatum durch Gewebederivatisierung und Massenspektrometrie-Imaging (MSI) untersucht. Coniferylaldehyd erwies sich als verlässliches und praktikables Derivat zum Nachweis von Schierlingsalkaloiden. Diese Alkaloide mit niedrigem Molekulargewicht wurden in den Blättern, Wurzeln, Sprossachsen und Früchten der Pflanze, durch Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI-MSI) nachgewiesen. Mit dieser Methode war es möglich, die beiden bekanntesten Schierlingsalkaloide und einige weitere Alkaloide ausfindig zu machen, die als mögliche Bestandteile der Pflanze beschrieben wurden. Außerdem wurde die Schlüsselaminosäure Alanin in der Alkaloid - Biosynthese entdeckt und die Position isomerer Alkaloide bestimmt. Darüber hinaus wurde die Verteilung der Alkaloide in gekeimten und nicht gekeimten Früchten untersucht, wobei sich eine Relokalisierung der Alkaloide in gekeimten Früchten zeigte. Anhand dieser Ergebnisse könnte diskutiert werden, wie die Pflanze Metaboliten verwendet, um ihre nächste Generation zu schützen. Schließlich wurde ein potenzielles neues Alkaloid entdeckt und mithilfe von MSI, MS und MS/MS (Tandem-Massenspektrometrie) analysiert. Als nächstes wurden ein neuartiger Endophytenpilz aus Aster tataricus und neue Azaphilonverbindungen aus diesem Endophyten isoliert. Außerdem wurde die krebshemmende Wirkung einer der neuen Verbindungen entdeckt. Die Pflanze A. tataricus wird seit mehr als 2000 Jahren in der traditionellen chinesischen Medizin verwendet. Kürzlich zeigte ein Endophyt dieser Pflanze die Fähigkeit, die bekanntesten Verbindungen der Pflanze zu produzieren, was das hohe chemische Potenzial ihrer Pilzendophyten zur Produktion zytotoxischer Wirkstoffe offenbarte. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurden Endophyten isoliert und ihre Extrakte vorab mit HeLa - Zellen und Caenorhabditis elegans untersucht, um ihre zytotoxische Aktivität zu bewerten. Anschließend erfolgte die Analyse der chemischen Zusammensetzung der Extrakte durch MS-Molekularnetzwerke und Dereplikation. Zusätzlich wurde eine morphologische Untersuchung der isolierten Pilze durchgeführt. Die bekannten Stämme wurden dann von den Untersuchungen ausgeschlossen. Diese Strategie ermöglichte es uns, einen neuen Pilzstamm, Tengochaeta bulbillosa, sowie fünf unbekannte Azaphilone (Bulbillosin A–E) zu isolieren. Bulbillosin A wurde durch den NCI-60 Human Tumor Cell Lines Screen charakterisiert, der eine hohe Tumorzellspezifität ergab. Abschließend wurde die Verteilung der isolierten Verbindungen auf Pflanzengeweben mittels MSI ausgewertet, welche darauf hindeutete, dass der Pilz auf der gesamten Pflanze vorhanden ist oder dass seine Bulbillosine durch die Pflanze von den Wurzeln zu den Blättern transportiert werden. Danach wurde die Lokalisierung von Astinen in Aster tataricus und die Kolokalisierung dieser Verbindungen mit Cyanodermella asteris in der Pflanze analysiert. A. tataricus ist dafür bekannt, zytotoxische Chlor- und Allo-Thr-haltige zyklische Pentapeptide, sogenannte Astine, zu enthalten. Strukturell unterscheiden sich diese Verbindungen durch das Vorhandensein von acetylierten Substituenten, Chloratomen oder dem Austausch einiger Aminosäuren im Ring. Eine der interessantesten Entdeckungen war jedoch, dass C. asteris, ein endophytischer Pilz von A. tataricus, die Astine C, F und G produzieren kann, die bislang nur als Bestandteil der Pflanze bekannt sind. Dieses faszinierende Ergebnis veranlasste uns, die Position der Astine direkt in Pflanzengeweben weiter zu untersuchen. Zur Lokalisierung der Astine wurde MSI verwendet, welches eine inhomogene Verteilung auf den verschiedenen Geweben offenbarte. Zur Ergänzung dieser Studie wurde der C. asteris-Stamm zusätzlich in mit NaCl angereichertem Medium kultiviert und die Zusammensetzung des Kultivierungsmediums plus Pilzhyphenextrakte mittels MS-Molekularnetzwerken ausgewertet. Der Vergleich zeigte das Vorhandensein der Astine C, F/M und G im nicht angereicherten Medium sowie im angereicherten Medium (wie zuvor festgestellt), aber auch andere bekannte und unbekannte Astine wurden in Gegenwart von Salz nachgewiesen. Dieses Ergebnis untermauert die Annahme, dass der Endophyt der einzige Organismus ist, der die Verbindungen innerhalb der Pflanze produziert, da der Pilz spezifische Bedingungen benötigt, um verschiedene Astine zu produzieren. Abschließend wurde die Zusammensetzung von Extrakten aus Einzel- und Kokultivierung von Bacillus amyloliquefaciens und Colletotrichum graminicola untersucht. Der Konfrontationstest zwischen C. graminicola und B. amyloliquefaciens deutete auf eine metabolische Reprogrammierung hin, da bei den Pilzhyphen Schwellungen, Farbveränderungen und Wachstumsstillstand beobachtet wurden. Untersuchungen zeigen, dass wachsende Stämme unter Laborbedingungen oft die Biosynthese wertvoller bioaktiver Verbindungen unterdrücken; sie könnte jedoch in Konfrontationsexperimenten reaktiviert werden. Die Analyse des mikrobiellen Stoffwechsels im Kokultivierungstest zeigte das Vorhandensein von 96 Ionen, die zu Stickstoffverbindungen gehören, welche bei Einzelkultivierung nicht produziert werden. Diese Ergebnisse deuteten auf die enorme metabolische Plastizität bei Konfrontationsexperimenten hin. Zusammenfassend wurde eine neue Art endophytischer Pilze identifiziert, fünf bisher unbekannte Azaphilone bestimmt und ein mögliches neues Schierlingsalkaloid entdeckt. Die MSI-Bilder ermöglichten ein tieferes Verständnis der Verteilung exogener und endogener Verbindungen in den Pflanzen und deren möglicher Beziehung zu ihrer Umwelt. Bezüglich möglicher Anwendungen der untersuchten Verbindungen wurde die vollständige Charakterisierung des Hauptbulbillosins als krebshemmende Substanz sowie die mögliche Verwendung von B. amyloliquefaciens zur Bekämpfung von C. graminicola beschrieben.
