Pyrrolizidine alkaloids are secondary plant metabolites that are found in herbal medicines and supplements, as contaminants in food such as teas and spices and in livestock feed. Within this structurally diverse group, the 1,2-unsaturated pyrrolizidine alkaloids (PAs) are subject of drug and food safety assessment due to their hepatotoxic, genotoxic and carcinogenic effects. Retrorsine, a prototypic hepatotoxic PA, is one of the most frequently detected PAs in tea samples. Current risk assessment is facing data gaps for PAs including retrorsine not only with regard to their absorption, distribution, metabolism and excretion (ADME) characteristics, but also in vivo dose-response studies that are needed to derive health-based exposure limits for consumers are missing. In addition, cytochrome P450 (CYP) 3A4 induction by drugs increases the formation of toxic CYP3A4 metabolites and thereby potentially enhances PA toxicity. However, a quantitative analysis of PA-drug interactions in humans is lacking. The objectives of this doctoral work were (1) in vitro ADME characterization of PAs (2) development and evaluation of a physiologically-based pharmacokinetic (PBPK) model for PAs including relevant biomarkers for hepatotoxicity, (3) in vitro-to-in vivo extrapolation of cellular hepato-cytotoxicity data by means of reverse PBPK modeling for mice and rats (4) PBPK-based simulation of human PA kinetics with CYP3A4 induction under patient-relevant conditions. Apart from the relevance for food safety, we selected retrorsine as representative PA for PBPK model development due to the availability of in vivo kinetic data of the parent compound and its CYP3A4 metabolites, speciffcally toxic DNA and protein adducts as well as detoxifying glutathione conjugates, in mice and rats. Since key in vitro ADME characteristics for retrorsine like lipophilicity, blood partitioning, plasma protein binding, intestinal absorption, hepatic uptake and metabolism are hitherto unknown, we designed, executed and analyzed corresponding experiments. Lipophilicity and blood partitioning were determined for retrorsine and additional PAs intermedine, lasiocarpine, monocrotaline and their N-oxides (PANOs). Remaining unknown parameters of the retrorsine PBPK model were estimated based on the available in vivo kinetic data using maximum likelihood estimation and Monte Carlo analysis. The PBPK model was evaluated with separate in vivo kinetic data. For extrapolation of liver toxicity, in vitro concentration-response data for retrorsine obtained from cytotoxicity assays with primary mouse and rat hepatocytes were translated to in vivo dose- response data by PBPK-based reverse modeling. We performed benchmark dose modeling of predicted dose-response data to obtain benchmark dose confidence intervals for acute liver toxicity of retrorsine in mice and rats. Regarding CYP3A4 induction, we focused on the antibiotic rifampicin due to its fullly available PBPK characterization for human. Daily intake of retrorsine from herbal tea was simulated for a time span of five weeks accompanied by a daily therapeutic dose of rifampicin for two weeks. PAs and PANOs were hydrophilic and had a low binding affinity toward red blood cells. Plasma protein binding of retrorsine was low indicated by the fraction unbound in plasma of 60.0%. The estimated fraction absorbed from the intestine of retrorsine was high (78.3%). Hepatic uptake of retrorsine showed species differences up to factor 2 between humans, rats and mice (1.02, 0.887 and 0.516 mL/min/g liver, respectively). Species-differences up to factor 4 were observed for the liver metabolic clearance of retrorsine, which was highest in rats, followed by humans and mice (2.07, 1.03 and 0.497 mL/min/g liver, respectively). The PBPK model of retrorsine was based on a generic structure with 13 anatomical compartments. Implementation of the liver compartment according to the extended clearance model allowed to integrate liver metabolism and transport. Unknown PBPK model parameters, speciffically intestinal absorption rate constant, biliary clearance and parameters related to formation and depletion of DNA and protein adducts and glutathione conjugates, were estimated with high precision. The parametrized PBPK model showed convincing predictivity by adequately describing hepatic retrorsine kinetics and its DNA adducts in mice. Translation of measured in vitro hepato-cytotoxicity data to in vivo acute liver toxicity of retrorsine resulted in benchmark dose 90% confidence intervals of 24.1 to 88.5 and 79.9 to 104 mg/kg body weight in mice and rats, i.e. that a single oral dose of retrorsine within this interval leads to a 5% increase in liver toxicity. For the simulated CYP3A4 induction, a reduction of retrorsine plasma 24 h-area under the curve and maximum concentration was observed. This reduction was strongest directly after rifampicin discontinuation (to 67% and 74% compared to rifampicin-free reference, respectively). Retrorsine kinetics returned to baseline 14 days after stop of rifampicin intake. After five weeks, the cumulative formation of toxic CYP3A4 metabolites of retrorsine, increased to 254% (from 10 to 25 nmol) in the intestine due to the impacted metabolism kinetics, but not in the liver (57 nmol). In summary, the developed PBPK model allowed to predict benchmark dose confidence intervals for acute liver toxicity based on in vitro data in absence of in vivo dose-response studies. Furthermore, the PBPK approach was shown to be an efficient tool to explore the interplay of enzyme induction and toxification pathways. Prospectively, the model can be utilized as a flexible tool for extrapolation to other relevant species or other hepatotoxic PAs.
Pyrrolizidinalkaloide sind sekundäre Pflanzenstoffe, die in pflanzlichen Arznei- und Nahrungsergänzungsmitteln, als Kontaminanten in Lebensmitteln wie Tees und Gewürzen und in Futtermitteln vorkommen. Innerhalb dieser strukturell vielfältigen Gruppe sind die 1,2-ungesättigten Pyrrolizidinalkaloide (PAs) aufgrund ihrer hepatotoxischen, genotoxischen und karzinogenen Wirkung Gegenstand der Bewertung von Arzneimittel- und Lebensmittelsicherheit. Retrorsin, ein prototypisches hepatotoxisches PA, ist eines der am häufigsten in Teeproben nachgewiesenen PAs. Die aktuelle Risikobewertung ist mit Datenlücken für PAs einschließlich Retrorsin konfrontiert, und zwar nicht nur im Hinblick auf ihre Absorptions-, Verteilungs-, Stoffwechsel- und Ausscheidungseigenschaften (ADME), sondern es fehlen auch in vivo Dosis-Wirkungs Studien, die zur Ableitung gesundheitsbezogener Expositionsgrenzwerte für Verbraucher erforderlich sind. Darüber hinaus wird die Bildung von toxischen CYP3A4-Metaboliten als Folge einer Cytochrom P450 (CYP) 3A4-Induktion durch Arzneimittel erhöht, wodurch möglicherweise die Toxizität von PAs verstärkt wird. Eine quantitative Analyse der Wechselwirkungen zwischen PAs und Arzneimitteln beim Menschen steht jedoch noch aus. Die Ziele dieser Doktorarbeit waren (1) die in vitro ADME-Charakterisierung von PAs, (2) die Entwicklung und Evaluierung eines Physiologie-basierten Pharmakokinetik (PBPK) Modells für PAs einschließlich relevanter Biomarker für Hepatotoxizität, (3) die Extrapolation von zellulären Hepato-Zytotoxizitätsdaten von in vitro zu in vivo mittels reverser PBPK-Modellierung für Mäuse und Ratten, und (4) die PBPK-basierte Simulation der Kinetik von PAs im Menschen mit CYP3A4- Induktion unter Patienten-relevanten Bedingungen. Abgesehen von der Relevanz für die Lebensmittelsicherheit haben wir Retrorsin als repräsentatives PA für die Entwicklung des PBPK-Modells ausgewählt, da Kinetikdaten für Retrorsin und seine CYP3A4-Metabolite, insbesondere toxische DNA- und Protein-Addukte und detoxifizierende Glutathion-Konjugate, in Mäusen und Ratten verfügbar sind. Da entscheidende in vitro ADME-Eigenschaften wie Lipophilie, Blutverteilung, Plasmaproteinbindung, intestinale Absorption, hepatische Aufnahme und Metabolismus für Retrorsin bisher unbekannt sind, haben wir entsprechende Experimente konzipiert, durchgeführt und analysiert. Lipophilie und Blutverteilung wurden für Retrorsin und die weiteren PAs Intermedin, Lasiocarpin, Monocrotalin und deren N-Oxide (PANOs) bestimmt. Die verbleibenden unbekannten Parameter des Retrorsin-PBPK-Modells wurden auf der Grundlage der verfügbaren Kinetikdaten mit Hilfe von Maximum-Likelihood-Schätzung und Monte-Carlo Analyse geschätzt. Das PBPK-Modell wurde mit separaten in vivo Kinetikdaten evaluiert. Für die Extrapolation der Lebertoxizität wurden die aus Zytotoxizitätstests mit primären Maus- und Rattenhepatozyten gewonnenen in vitro Konzentrations-Wirkungs-Daten für Retrorsin durch PBPK-basierte reverse Modellierung in in vivo Dosis-Wirkungs-Daten übersetzt. Wir haben eine Benchmark-Dosis Modellierung der vorhergesagten Dosis-Wirkungs-Daten durchgeführt, um Benchmark-Dosis-Konfidenzintervalle für die akute Lebertoxizität von Retrorsin in Mäusen und Ratten zu erhalten. Im Hinblick auf die CYP3A4-Induktion, konzentrierten wir uns auf das Antibiotikum Rifampicin, für welches eine PBPK-Charakterisierung für den Menschen vollständig vorliegt. Die tägliche Einnahme von Retrosin in Kräutertee wurde über einen Zeitraum von fünf Wochen simuliert und begleitet von der täglichen Einnahme einer therapeutischen Dosis von Rifampicin über zwei Wochen. PAs und PANOs waren hydrophil und hatten eine geringe Bindungsaffinität zu roten Blutkörperchen. Die Plasmaproteinbindung von Retrorsin war gering, was durch die ungebundene Fraktion im Plasma von 60,0 % angezeigt wird. Die geschätzte vom Darm absorbierte Fraktion von Retrorsin war hoch (78,3%). Der Aufnahmetransport von Retrorsin in die Leber zeigte Speziesunterschiede bis zum Faktor 2 zwischen Menschen, Ratten und Mäusen (1,02, 0,887 bzw. 0,516 ml/min/g Leber). Für die metabolische Clearance von Retrorsin in der Leber wurden Speziesunterschiede bis zum Faktor 4 beobachtet: die höchste metabolische Clearance wurde in Ratten bestimmt, gefolgt von Menschen und Mäusen (2,07, 1,03 bzw. 0,497 ml/min/g Leber). Das PBPK-Modell von Retrorsin basiert auf einer generischen Struktur mit 13 anatomischen Kompartimenten. Die Implementierung des Leberkompartiments entsprechend dem Extended Clearance-Modell ermöglichte die Integration von Lebermetabolismus und -transport. Unbekannte Parameter des PBPK-Modells, insbesondere die intestinale Absorptionsratenkonstante, die biliäre Clearance und Parameter für Bildung und Abbau von DNA-, Protein-Addukten und Glutathion-Konjugaten, wurden mit hoher Präzision geschätzt. Das parametrisierte PBPK-Modell zeigte eine überzeugende Prädiktivität, indem es das hepatische Retrorsin und seine DNA-Addukte bei Mäusen adäquat vorhersagte. Die Übertragung der gemessenen in vitro Daten zur Hepato-Zytotoxizität auf die akute Lebertoxizität von Retrorsin ergab bei Mäusen und Ratten 90% Konfidenzintervalle für die Benchmark-Dosis von 24,1 bis 88,5 und 79,9 bis 104 mg/kg Körpergewicht. Das heißt, dass eine orale Einzeldosis von Retrorsin innerhalb dieses Intervalls zu einem Anstieg der Lebertoxizität um 5% führt. Bei der simulierten CYP3A4-Induktion wurde eine Reduktion der 24-h Area-under-the-curve und der maximalen Konzentration von Retrorsin im Plasma beobachtet. Diese Reduktion war direkt nach Absetzen von Rifampicin am stärksten (reduziert auf 67 % bzw. 74 % im Vergleich zur Rifampicin-freien Referenz). Die Kinetik von Retrorsin kehrte 14 Tage nach Stopp der Rifampicin-Behandlung auf ihren Basiswert zurück. Nach fünf Wochen stieg die kumulative Bildung von toxischen CYP3A4- Metaboliten von Retrorsin aufgrund der beeinträchtigten Stoffwechselkinetik im Darm auf 254% an (von 10 auf 25 nmol), nicht aber in der Leber (57 nmol). Zusammenfassend ermöglicht das entwickelte PBPK-Modell die Vorhersage der Benchmark-Dosis für die akute Lebertoxizität auf der Grundlage von in vitro Daten in Abwesenheit von in vivo Dosis-Wirkungsstudien. Darüber hinaus erwies sich der PBPK-Ansatz als effizientes Mittel, um das Zusammenspiel von Enzyminduktions- und Toxifizierungswegen zu untersuchen. Zukünftig kann das Modell als flexibles Werkzeug für die Extrapolation auf andere relevante Spezies oder auf andere hepatotoxische PAs genutzt werden.
