This thesis explores the influence of sawfly sex pheromones and the role of needle age in shaping pine defences against sawfly infestation. The research is centred on how pine trees respond to sex pheromones emitted by sawflies and how these responses modulate both direct and indirect pine defences against sawflies. Furthermore, it delves into how the age of pine needles affects their susceptibility to sawfly attack. All studies were conducted with young Scots pine trees (Pinus sylvestris) and the sawfly Diprion pini in the laboratory. Larvae of this sawfly species gregariously feed upon pine needles and may heavily damage pine forests. The first major focus of the experimental part of this thesis was the investigation of the effect of D. pini sex pheromones on pine direct defences. Previous studies have shown that responses of Scots pine to these sex pheromones result in enhanced accumulation of hydrogen peroxide in pine needles and subsequently to reduced D. pini egg survival rates. Hence, exposure of pine to the pheromones enhances (primes) pine defences against sawfly eggs. • In the study here, we first addressed the question whether D. pini females evolved a counter-adaptation to the pheromone-mediated Scots pine defence against sawfly eggs by avoiding pheromone-exposed pine trees for oviposition. The bioassays showed that the sawfly females cannot discriminate between the odour of pheromone-exposed and unexposed pine trees. However, upon contact with pine trees, D. pini females preferred oviposition on unexposed trees and were reluctant to lay their eggs on the pheromone-exposed trees. • We further studied whether the improved defensive effects of pheromone-exposed Scots pine on sawfly eggs also extend to defence against sawfly larvae hatching from survived eggs. However, exposure of pine to sawfly sex pheromones did not affect the weight of larvae nor their pupation success. • Thus, pine responses to D. pini sex pheromones affect (enhance) the defence against the initial step of sawfly infestation, i.e. the egg deposition, but not the defence against later insect developmental stages. The results are discussed with respect to two well known hypotheses in entomology, i.e. the “mother knows best” hypothesis and “oviposition preference – insect performance” hypothesis. The second focus of the experimental part of this thesis addressed the question whether the pheromone-mediated priming of pine responses is restricted to direct defences against sawfly eggs or if it also enhances indirect defences of pine trees against eggs. We first examined whether (i) exposure of egg-free P. sylvestris trees to D. pini sex pheromones renders pine attractive to egg parasitoids of D. pini, and/or (ii) whether exposure of pine to first the pheromones and subsequently to D. pini egg deposition can prime the known egg-induced emission of (E)-β-farnesene from pine needles. This sesquiterpene has been shown in previous studies to attract egg parasitoids when combined with four other non-induced pine terpenoids. • Our study revealed that the egg parasitoid Closterocerus ruforum did not distinguish between the odour from pheromone-exposed and unexposed trees without sawfly eggs. • Chemical analysis of pine volatile profiles by coupled gas chromatography - mass spectrometry further showed that pheromone exposure did not significantly change the emission of (E)-β-farnesene from pine needles, regardless of the presence of eggs. However, as demonstrated in previous analyses of the odour of egg-laden branches of mature pines, sawfly egg deposition induced the emission of (E)-β-farnesene also in the young pine trees used in the studies of this thesis. Furthermore, the chemical analysis revealed that D. pini egg deposition on the young pines additionally induced the emission rate of (Z)-β-ocimene, one of the four terpenes relevant for attracting C. ruforum when combined with enhanced emission rates of (E)-β-farnesene. • The results are discussed in the context of previous knowledge of this tripartite interaction (P. sylvestris – D. pini – C. ruforum), considering the potential trade-offs between direct and indirect defence due to resource allocation costs. The third experimental part of the thesis addressed the question of how the age of P. sylvestris needles influences their defences against D. pini larval herbivory. It is well known that juvenile foliage of angiosperms shows different responses to stress than a few months older, mature foliage. However, much less is known about age-dependent stress responses of conifer needles, which may become several years old. To address this gap in knowledge, proteinase inhibitor (PI) activities and phytohormone concentrations (jasmonic acid, jasmonic acid-isoleucine, salicylic acid, and abscisic acid) of current-year (young) and previous-year (old) pine needles were analysed; untreated needles of these ages and needles damaged by D. pini larvae were used. The study further tested how the insect responds to pine foliage of different age. Thus, we could elucidate how a pine-specialised insect copes with age-dependent needle defences. • The results of this third part showed that young and old pine needles responded to larval feeding damage similarly with respect to the damage-induced increase of jasmonic acid and jasmonic acid-isoleucine concentrations. However, levels of salicylic acid and abscisic acid were induced by sawfly feeding damage to a higher level in young than old pine needles. PI activities were constitutively higher in young needles, but were not significantly inducible upon sawfly feeding, neither in young nor old needles. • Sawfly females preferred to oviposit on old needles, where larvae gained most weight. • This study highlights the plasticity of pine defence traits across different needle ages. The results show some differences between age-dependent foliage responses of angiosperms and pine to herbivory, but also similarities. Moreover, our study elucidates the ability of a pine-specialised herbivore to adapt to defences of its host. Our results are consistent with a long-studied hypothesis in entomology (“oviposition preference – insect performance” hypothesis) as well as with the “optimal plant defence theory”, according to which young foliage is particularly valuable. In conclusion, the results of this thesis offer significant novel insights into the chemical ecology of Scots pine and its interactions with herbivorous sawflies. The general introduction outlines the state of the art on (priming of) plant defences against insect infestation prior to this thesis. The general discussion focuses on the mechanisms by which plants perceive volatile organic compounds and further addresses pheromone-mediated priming and the influence of leaf and plant age on anti-herbivore defence. The results of this thesis may contribute to a deeper understanding of plant - insect interactions.
Diese Doktorarbeit untersuchte den Einfluss von Sexualpheromonen einer Blattwespe auf die Abwehr der Waldkiefer gegen Blattwespenbefall. Die Forschung konzentrierte sich darauf, wie Kiefern auf Pheromone der Blattwespen reagieren und wie diese Reaktionen sowohl die direkte als auch die indirekte Abwehr gegen Blattwespenbefall modulieren. Darüber hinaus wurde untersucht, wie das Alter der Kiefernnadeln deren Anfälligkeit für Blattwespenbefall beeinflusst. Alle Untersuchungen wurden im Labor mit jungen Waldkiefern (Pinus sylvestris) und der Kiefernbuschhornblattwespe Diprion pini durchgeführt. Die Larven dieser Blattwespenart fressen gregär an Kiefernnadeln und können Kiefernwälder erheblich schädigen. Der erste Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf Untersuchungen zur Wirkung von D. pini Sexualpheromonen auf die direkten Abwehrmechanismen der Kiefer. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Reaktionen der Waldkiefer auf diese Pheromone zu einer verstärkten Konzentration von Wasserstoffperoxid in Kiefernnadeln und in der Folge zu einer reduzierten Überlebensrate der D. pini Eier führen. Demnach verstärkt die Pheromon-Exposition von Kiefern die Abwehr gegen Blattwespeneier. • In der hier vorliegenden Studie wurde zunächst untersucht, ob D. pini Weibchen eine Gegenanpassung an die Pheromon-vermittelte Kiefernabwehr entwickelt haben, indem sie Pheromon-exponierte Kiefern für die Eiablage meiden. Die Biotests zeigten, dass Blattwespenweibchen den Geruch von Pheromon-exponierten und nicht-exponierten Kiefern nicht unterscheiden können. Bei Kontakt mit den Kiefern bevorzugten sie jedoch die Eiablage auf nicht-exponierten Bäumen und waren zögerlich, ihre Eier auf zuvor Pheromon-exponierten Bäumen abzulegen. • Ferner wurde untersucht, ob sich die verbesserte Abwehr Pheromon-exponierter Waldkiefern gegen Eier auch auf die Abwehr gegen Blattwespenlarven erstreckt, die aus überlebenden Eiern schlüpfen. Die Pheromon-Exposition der Kiefer nahm keinen Einfluss auf das Gewicht der Larven und deren Verpuppungserfolg. • Somit haben die Reaktionen der Kiefer auf D. pini Sexualpheromone zwar einen verstärkenden Effekt auf die Abwehr gegen den ersten Schritt des Blattwespenbefalls, nämlich die Eiablage, aber nicht auf die Abwehr gegen spätere Entwicklungsstadien des Insekts. Die Ergebnisse werden im Zusammenhang mit der in der Entomologie gut bekannten „mother knows best“-Hypothese und der Hypothese zur „oviposition preference – insect performance“ diskutiert. Der zweite Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Frage, ob die Pheromon-vermittelte Prägung der Kieferabwehr beschränkt ist auf direkte Abwehr gegen Blattwespeneier oder ob sie auch indirekte Abwehr der Waldkiefer gegen Eier verstärkt. Wir haben geprüft, ob (i) die Pheromon-Exposition von Ei-freien Kiefern die Bäume attraktiv macht für Eiparasitoide von D. pini und/oder (ii) ob die Pheromon-Exposition der Kiefern mit nachfolgender Eiablage auch die (bereits bekannte) Eiablage-induzierte Emission von (E)-β-Farnesen aus den Kiefernnadeln prägen (verstärken) kann. Für dieses Sesquiterpen ist bekannt, dass es in Kombination mit vier anderen nicht-induzierten Terpenen der Kiefernadeln die Eiparasitoide anlockt. • Unsere Studie zeigte, dass der Eiparasitoid Closterocerus ruforum nicht zwischen dem Duft von Pheromon-exponierten und nicht-exponierten Bäumen ohne Blattwespeneier unterscheiden konnte. • Chemische Analysen der Duftprofile mittels gekoppelter Gaschromatographie-Massenspektrometrie ergaben, dass eine Pheromon-Exposition die Emission von (E)-β-Farnesen nicht signifikant veränderte, weder in Waldkiefern mit Blattwespeneiern noch in solchen ohne Eier. Wie jedoch bereits in früheren Duftanalysen von Eier-belegten Zweigen älterer Kiefernbäume gezeigt worden war, induzierte die Eiablage von Blattwespen die Freisetzung von (E)-β-Farnesen auch in den hier untersuchten jungen Waldkiefern. Darüber hinaus zeigte sich, dass die Eiablage von D. pini auf den jungen Kiefern zusätzlich die Emissionsrate von (Z)-β-Ocimen erhöhte. (Z)-β-Ocimen ist eines der vier Terpene, die in Kombination mit erhöhten Emissionsraten von (E)-β-Farnesen für die Anlockung von C. ruforum relevant sind. • Die Ergebnisse werden im Zusammenhang mit dem bisherigen Wissen über diese tritrophische Interaktion (P. sylvestris – D. pini – C. ruforum) diskutiert; dabei werden unter anderem die potenziellen trade-offs zwischen direkter und indirekter Abwehr aufgrund von Ressourcenallokationskosten beleuchtet. Der dritte Teil der experimentellen Arbeiten befasste sich mit der Frage, wie das Alter der P. sylvestris Nadeln deren Abwehr gegen Fraß durch Blattwespenlarven beeinflusst. Junge Blätter von Angiospermen reagieren bekanntlich anders auf Stress als einige Monate ältere, reife Blätter. Weniger bekannt ist jedoch über die Altersabhängigkeit der Stressreaktionen von Koniferennadeln, die mehrere Jahre alt werden können. Diese Wissenslücke wurde adressiert, indem Proteinase-Inhibitor (PI) Aktivitäten und Phytohormonkonzentrationen (Jasmonsäure, Jasmonsäure-Isoleucin, Salicylsäure und Abscisinsäure) in jungen (diesjährigen) und alten (vorjährigen) Kiefernadeln analysiert wurden; dabei wurden unbehandelte Nadeln dieser Altersgruppen und Nadeln, die durch D. pini Larvalfraß geschädigt waren, untersucht. Diese Studie testete auch, wie die Blattwespen auf Nadeln unterschiedlichen Alters reagieren. So wurde beleuchtet, wie ein auf Kiefernbäume spezialisiertes Insekt mit altersabhängigen Abwehrreaktionen der Kiefernnadeln umgeht. • Die Ergebnisse dieses dritten Teils der Arbeit zeigten, dass junge und alte Kiefernnadeln auf Larvalfraß ähnlich reagierten, wenn man den fraßinduzierten Anstieg der Jasmonsäure(-Isoleucin)-Konzentration betrachtet. Die Konzentrationen von Salicylsäure und Abscisinsäure waren durch Larvalfraß in jungen Nadeln allerdings stärker induziert als in alten. Die PI Aktivitäten waren konstitutiv höher in jungen Nadeln, aber sie waren nicht signifikant induzierbar durch Larvalfraß, weder in alten noch in jungen Nadeln. • Die Blattwespenweibchen bevorzugten zur Eiablage die alten Nadeln, an denen die Larven auch das meiste Gewicht erzielten. • Diese Studie zeigt deutlich, wie plastisch einige Merkmale der Abwehr der Waldkiefer über verschiedene Nadelalter hinweg sind. Es zeigten sich einige Unterschiede, aber auch Gemeinsamkeiten zwischen den blattaltersabhängigen Reaktionen von Angiospermen und Kiefern auf Herbivorie. Darüber hinaus verdeutlicht die Studie die Fähigkeit eines auf Kiefern spezialisierten Herbivoren, sich an Abwehrmechanismen des Wirtes anzupassen. Die Ergebnisse stimmen sowohl mit einer langjährigen Hypothese in der Entomologie („oviposition preference – insect performance“ Hypothese) als auch mit der Theorie der optimalen Pflanzenabwehr überein, wonach junge Blätter besonders wertvoll sind. Zusammenfassend bieten die Untersuchungen dieser Doktorarbeit aufschlußreiche, neue Einblicke in die chemische Ökologie der Interaktionen zwischen Waldkiefer und herbivoren Blattwespen. In der allgemeinen Einleitung wird der vor dieser Doktorarbeit bekannte Stand der Forschung über pflanzliche Abwehr gegen Insektenbefall und über Prägung (Priming) dieser Abwehr skizziert. Die allgemeine Diskussion befasst sich mit möglichen Mechanismen, mit denen Pflanzen flüchtige organische Verbindungen wahrnehmen, sowie mit Pheromon-vermitteltem Priming und dem Einfluss des Blatt- und Pflanzenalters auf die Abwehr. Die Resultate dieser Arbeit können einen Beitrag zu einem tieferen Verständnis von Pflanzen-Insekten Interaktionen leisten.
