Fragestellung: Die RTK Axl spielt eine bedeutende Rolle in der Pathogenese des Glioblastoms und ist unter anderem für Angiogenese, Tumorzellproliferation und -migration sowie Immunosuppression und Chemoresistenz in verschiedenen Tumorentitäten verantwortlich. In der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle Axl’s im Rahmen unterschiedlicher Pathomechanismen des Glioblastoms (unter RTK-Inhibition, Bestrahlung und in hypoxischen Tumorarealen) untersucht werden. Zunächst erfolgte die Inhibition der Axl-Aktivierung durch den hoch spezifischen SMI R428. Anschließend wurde die Rolle Axl’s bei Inhibition der RTK MET mit dem Inhibitor ARQ197 studiert, um festzustellen, ob Axl unter MET-Inhibition als Ausweichsignalkaskade genutzt wird. Danach untersuchten wir die Rolle Axl’s im Rahmen der – standardmäßig beim Glioblastom durchgeführten – Radiotherapie. Hierbei gingen wir davon aus, dass die Axl-Signalkaskade in strahlenresistenteren Zellen überaktiviert ist. Zuletzt sollte noch Axl’s Bedeutung in hypoxischen Tumorarealen analysiert werden, da Vorstudien zeigen konnten, dass die Rezeptordichte in diesen Arealen besonders hoch ist.
Methodik: Die beiden Glioblastom-Zelllinien SF126 und U118MG (in einzelnen Expe-rimenten auch weitere Zelllinien) wurden in jeweils unterschiedlichen Experimenten mit den Inhibitoren R428 oder ARQ197 behandelt, bestrahlt oder in einer Hypoxiekammer inkubiert. Anschließend wurden MTT-Assays und Colony Formation-Assays durchgeführt und RNA bzw. Proteine isoliert und hieraus qPCRs (Zielgene: Axl, MET, EGFR, Snail, Slug, TWIST, HIF1α) bzw. Western Blots (für Axl, Phospho-Axl779, MET, HIF1α) sowie Phospho-RTK-Arrays erstellt.
Ergebnisse: Die Behandlung der Zellen mit R428 führt zu einer verminderten Zellviabilität sowie zu einer vermehrten Axl-Expression und zu vermehrtem Axl-Shedding. In unbehandelten U118MG-Zellen sind zahlreiche RTKs überexprimiert. Die Behandlung mit R428 führt zu einer verminderten Axl-Phosphorylierung. Unter der Therapie mit ARQ197 konnten wir keine erhöhte Axl-Transkription (Kinasen-Switch) nachweisen. Die Radiosensitivität unterschiedlicher Glioblastom-Zelllinien variiert stark. Die Axl-Expression spielt hierbei in genetisch veränderten SF126-Zellen eine Rolle: Axl-Überexpression führt zu einer höheren Strahlenresistenz und ein Axl-Knockdown zu mehr Strahlensensitivität. Axl ist in der strahlenresistenteren Zelllinie SF126 unter Bestrahlung hyperphosphoryliert und eine Kombination von Bestrahlung und Axl-Inhibition hat hier einen synergistischen Effekt. Unter Hypoxie kommt es zu vermehrtem Axl-Shedding.
Fazit: Die Axl-Signalkaskade kann im Glioblastom Strahlenresistenz induzieren und scheint in hypoxischen, besonders malignen Tumorarealen überexprimiert zu sein. Die spezifische Axl-Inhibition kann diese Mechanismen teilweise umkehren, wobei Wechselwirkungen mit anderen RTK-Signalkaskaden – z.B. MET – bedacht werden müssen. Weitere translationale Modelle sind notwendig, um dies genauer zu studieren.
Purpose: The receptor tyrosine kinase Axl plays an important role in the pathogenesis of glioblastoma and is responsible for angiogenesis, tumor cell proliferation and migration, immunosuppression and chemoresistance in different tumor entities. Here, we want to examine Axl’s role in different pathophysiological situations (RTK-inhibtion, radiation and hypoxic tumorniches). First, we applied the highly specific Axl-small molecule inhibitor R428 and studied the effects. We then were interested in the role of Axl as a bypass mechanism under MET-inhibition with ARQ197. Next, we investigated the role of Axl in the standard-of-care radiotherapy in glioblastoma, assuming an activation of the Axl signaling cascade in radioresistant cell lines. Lastly, we analyzed Axl’s function in hypoxic tumor zones since precedent studies showed a high receptor prevalence in these regions.
Methods: The two glioblastoma cell lines SF126 and U118MG (in some experiments additional cell lines have been used) were in individual experiments either treated with the inhibitors R428 or ARQ197, irradiated or incubated in a hypoxia chamber. We then performed MTT-assays, colony formation assays and isolated RNA and proteins. After which we performed qPCRs (targets: Axl, MET, EGFR, Snail, Slug, TWIST, HIF1α), Western Blots (for Axl, Phospho-Axl779, MET, HIF1α) and phospho-receptor tyrosine kinase-arrays.
Results: Treatment of the cells with R428 lead to a decrease of cell viability and an increase in Axl-expression and -shedding. Untreated U118MG cells overexpress numerous receptor tyrosine kinases. R428 treatment leads to a decrease in Axl-phosphorylation. Under the treatment with ARQ197 we could not find a decreased Axl-transcription (kinase switch). The radiosensitivity of different glioblastoma cell lines varies. The expression of Axl in genetically modified SF126 cells impacted the radiosensitivity: Axl overexpression leads to an increased radio resistance and Axl-knockdown leads to more radiosensitivity. Axl is hyperphosphorylated in the radioresistant cell line SF126 and a combination of radiation and Axl-inhibition has a synergistic effect in this cell line. Under hypoxia we found increased Axl-shedding.
Conclusion: The Axl signaling cascade can induce radio resistance and seems to be overexpressed in hypoxic – especially malignant – tumor areas. A specific Axl-inhibition can in part reverse these mechanisms but interactions with other RTK signal-ing cascades – for example MET – have to be kept in mind. Further translational re-search is necessary to further understand the importance.
