Die zentrale Fragestellung dieser Arbeit war, inwiefern strukturelle Eigenschaften von zellpenetrierenden Peptiden für die Vermittlung der zellulären Aufnahme sowie biologischen Wirkung von hydrophilen Wirkstoffen eine Rolle spielen. Als Peptidkomponente wurde in der vorliegenden Arbeit schwerpunktmäßig das zellpenetrierende a-helikale amphipathische Modell-Peptid KLALK LALKA LKAAL KLA-NH2 (KLA) verwendet, dessen Struktur hinsichtlich Ladung, Amphipathie sowie Helizität variiert wurde, um den Einfluss der Peptidstruktur auf die Funktion als Schleppermolekül zu ermitteln. Als Transportsubstrat dienten Peptidnukleinsäuren, die als typische Beispiele für hoch flexible Biopolymere mit hoher Polarität und Wasserstoffbrücken-Bildungs-Fähigkeit, die einerseits die Voraussetzung für deren spezifische Wirkung darstellt, aber auch andererseits für deren geringe Membranpermeabilität verantwortlich ist, gelten. Es konnte gezeigt werden, dass die PNA-Peptid-Konjugate effizient in Zelllinien unterschiedlicher Gewebe und Herkunft aufgenommen werden. Die Untersuchungen verdeutlichen jedoch, dass die Struktur der Peptide keinen wesentlichen Einfluss auf deren Schlepperfähigkeiten hat, was einen erhöhten Freiheitsgrad für die Optimierung zellpenetrierender Sequenzen bedeutet. Strukturelle Einflüsse der Peptide wurden in den Untersuchungen der Lokalisation der Konjugate in zellulären Kompartimenten deutlich. Peptide mit den für CPPs typischen Strukturmerkmalen, wie positive Ladung und Amphipathie, zeigten eine diffuse Verteilung im Zytsol und Nukleus, während Peptide, die Mangel an diesen Charakteristika aufwiesen, bevorzugt in vesikuläre Kompartimente internalisiert wurden. Trotz vergleichbarer Internalisierung erwiesen sich die Peptid-PNA-Konjugate als deutlich vorteilhafter gegenüber der unkonjugierten PNA für die Antisense- Aktivität in beiden der in dieser Arbeit vorgestellten biologischen Modellen (Cardiomyozyten, Splicing-Korrektur-Assay). Eine biolabile Disulfidbrücke als Linker zwischen Peptid und PNA war für eine effiziente Antisense-Wirkung nicht notwendig. Die biostabileren, amidverknüpften Konjugate wiesen zum Teil eine deutlich höhere Aktivität als die disulfidverbrückten Konstrukte auf. Darüber hinaus wurde der Einfluss der Peptidposition auf die biologische Wirkung der Konjugate untersucht. Hierbei zeigten Konjugate, deren Peptidreste an den N-Terminus der PNAs gekoppelt wurden, signifikant höhere Antisense-Aktivitäten als die C-terminal verknüpften Analoga. Somit konnte der N-Terminus der PNA als bevorzugte Verknüpfungsstelle des Peptides ermittelt werden. Des Weiteren wurden signifikante Einflüsse der Peptidstruktur auf die biologische Aktivität der Konjugate deutlich. Amphipathie und positive Ladung, die für die Membrantranslokation keine entscheidende Rolle spielten, wurden hierbei als essentielle Komponenten für eine effektive Antisense-Aktivität identifiziert. Die gefundenen Strukturmerkmale tragen somit zu einem optimierten Design von Peptid-PNA-Konjugaten bei.
Cell-Penetrating Peptides (CPPs) have received much attention over the past decade due to their ability to traverse cellular membranes and potentially deliver attached therapeutic cargoes to their target within the cytosol or nucleus. CPPs differ greatly in their amino acid content and overall structure, and consequently general rules for their rational design remain elusive. The aim of this work was to investigate the influence of the structural characteristics of CPPs on their ability to transport Peptide Nucleic Acid (PNA) antisense cargoes into mammalian cells. The peptides studied were the a-helical amphipathic peptide KLALK LALKA LKAAL KLA-NH2 (Model Amphipathic Peptide, MAP) and analogues that differed from the parent peptide with respect to charge, helicity and amphipathicity. These were compared to the well-known CPPs Tat and Penetratin. PNA, a charge-neutral backbone oligonucleotide analogue that binds strongly to either RNA or DNA, has poor membrane translocation properties and therefore requires assistance for its delivery to its target within cells. The uptake of PNA-peptide disulfide-linked conjugates was assessed by means of Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence detection (CE-LIF). All PNA-peptide conjugates studied, including those containing unstructured or negatively charged peptide moieties, were extensively taken up by various cell types suggesting that intracellular delivery of PNAs can be effected with a diverse range of peptides. However, peptide structure did influence the compartmental localisation of the corresponding conjugates invatigated by confocal laser-scanning microscopy. Peptides that were both cationic and amphipathic imparted a diffuse distribution in cytosol and nucleus whereas PNA-peptide conjugates of other peptides, which lacked one or both of these attributes were localised inside vesicles. Although similar levels of cell-uptake were found for PNA-peptide and free PNA, the former showed higher antisense activities in two of the biological models studied (cardiomyocyte and splicing correction assays). It transpired that a biolabile linker, such as a disulfide bond, was neither required nor more effective than a stable linker as demonstrated by the higher activity of stably-linked PNA-peptide conjugates in the splicing correction assay. Additionally, it was found that the position of the delivery peptide impacted on conjugate biological activity since peptides coupled to the N-terminus of the PNAs providing more potent substrates than those where the peptide was attached to the C-terminus. The structural features of the peptides conjugated, although unimportant for membrane translocation, were found to be highly influential for antisense activity. It was found that PNA conjugates of peptides that possessed both cationic charge and amphipathicity exhibited enhanced activity. Other conjugates containing solely cationic peptides, such as well-known CPPs Tat and Penetratin, as well as a negatively charged PNA- peptide conjugate, did not show improved activity compared to the free PNA control despite being efficiently internalised. These results indicate that there is no direct correlation between cellular uptake and biological activity suggesting other factors, such as binding to intracellular targets and facilitating endosomal release, might play key roles in enhancing the biological activity of PNA-peptide conjugates.
