Capillary electrophoresis coupled to mass-spectrometry (CE-MS) and matrix- assisted laser desorption ionization imaging mass-spectrometry (MALDI-MSI) emerged as highly reproducible techniques to discover potential naturally occurring peptide biomarkers in urine and fresh-frozen renal tissue samples. These biomarkers were established for the non-invasive diagnosis and prognosis of renal diseases. The first part of the PhD thesis in investigation of the performance of an established urinary proteome-based classifier (“CKD273”) depicting progression in different CKD stages and the relevance of changes in individual urinary peptides for the pathophysiology of CKD by the analysis of urine proteome profiles. Out of 2,672 samples included in the study, 394 individuals displayed a decline in eGFR of >5ml/min/1.73m2 per year (defined as progressively diseased). In early CKD stages the “CKD273”-classifier performed significantly better than the clinical marker “albuminuria” in detecting progressors, while albuminuria performed better in patients at late stages of CKD. At early CKD stages, collagen fragments were highly excreted in urine, while at moderate and late stage of CKD, markers of inflammatory process and functional loss (such as alpha-1-antitrypsin, CD99 antigen, antitrombin III, serum albumin etc.) were more abundant. Secondly, MALDI-MSI was applied to bioptic renal tissue from patients with focal segmental glomerulosclerosis (n=6), IgA nephropathy, (n=6) and membranous glomerulonephritis (n=7), and from controls (n=4) to define molecular signatures of primary glomerulonephritis. Signal of m/z 4,048 present in MALDI-MS imaging was identified as α-1-antitrypsin (A1AT). By immunohistochemistry it was shown that A1AT was localized to the podocytes within sclerotic glomeruli. This suggested that A1AT could be a marker of podocyte-stress correlating with development of focal segmental glomerulosclerosis. Additionally, correlation of MALDI-MSI findings with CE-MS findings of urinary peptidomics identified the same A1AT peptide as up- regulated in CKD patients. In the final part of the thesis assessment of urinary biomarkers for different aetiologies of CKD was investigated by the identification of peptides contained in 1,180 urine samples analysed via CE- MS. For 7 type of CKDs, potential biomarkers were defined and combined into classifiers. Validation of these classifiers in an independent cohort showed accuracy ranging from 0.77 to 0.95 for discrimination of one CKD etiology from the other. Sequence analysis of the biomarkers provided link to pathophysiology of CKD.
Die direkt mit einer Flugzeit-Massenspektrometrie (CE-MS) gekoppelte Kapillarelektrophorese sowie die bildgebende matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisation Massenspektrometrie (MALDI-IMS) haben sich als hoch- reproduzierbare Techniken zur Identifizierung von potentiellen natürlich vorkommenden Peptidbiomarkern in Urin beziehungsweise Nierengewebeproben erwiesen. Diese Biomarker wurden für die nicht-invasive Diagnose und Prognose von Nierenerkrankungen etabliert. Im ersten Teil der Dissertation habe ich die Leistung des auf dem Urinproteom-basierenden Biomarkermodells “CKD273“ untersucht, das zur Klassifizierung von chronischen Nierenerkrankungen (CKD) etabliert worden ist. Dabei wurde die Vorhersage der Progression der CKD in verschiedenen Krankheitsstadien durch die Klassifikation von Urinproteomprofilen beurteilt. Weiterhin wurde die Bedeutung von Veränderungen einzelner Peptide für das Verständnis des pathophysiologischen Mechanismus der CKD Progression beurteilt. Für diese Beurteilungen wurde das Urinproteom von 2.672 Patienten mit verschiedenen CKD Stadien untersucht. Von diesen Patienten zeigten 394 einen Rückgang der geschätzten glomerularen Filtrationsrate (eGFR) von >5 ml/min/1,73m2 pro Jahr und wurden daher als progressiv Erkrankte eingestuft. In frühen CKD-Stadien zeigte der “CKD273“-Klassifier im Vergleich zum bekannten klinischen Marker Albuminurie eine bessere prognostische Leistung bei der Identifikation von progressiv Erkrankten. Im Gegensatz dazu zeigte in späten Stadien der CKD die Albuminurie die bessere prognostische Leistung. Darüber hinaus lieferte die Entdeckung einer erhöhten Ausscheidungsrate von Kollagenfragmenten im Urin in einem frühen Stadium der CKD und von Markern entzündlicher Prozesse und eines Funktionsverlusts (z.B. alpha-1-Antitrypsin, Antithrombin III, Serumalbumin, usw.) Hinweise auf den pathophysiologischen Mechanismus der Progression. Im zweiten Teil der Dissertation wurde MALDI-IMS auf Nierengewebebiopsien angewandt, um molekulare Signaturen einer primären Glomerulonephritis zu definieren. Die Biopsien stammten von Patienten mit einer fokal segmentalen Glomerulosklerose, IgA- Nephropathie, und membranöser Glomerulonephritis sowie von gesunden Kontroll- Probanden. Ein Massenpeak mit einem m/z-Verhältnis von 4.048 wurde als α-1-Antitrypsin (A1AT) identifiziert. Die Immunhistochemie zeigte, dass das α-1-Antitrypsin in Podozyten der sklerotischen Glomeruli lokalisiert ist. α-1-Antitrypsin kann somit als Marker für zellulären Stress der Podozyten bei der Entwicklung einer fokalen segmentalen Glomerulosklerose dienen. CE-MS- basierende peptidomische Untersuchungen bestätigten die verstärkte Ausscheidung desselben A1AT Peptidfragments im Urin von CKD-Patienten und somit die MALDI-IMS Ergebnisse. Im dritten Teil der Dissertation sollten spezifische Biomarker für verschiedene Ätiologien der CKD identifiziert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, analysierte ich die auf CE-MS basierenden Peptidome von 1.180 Urinproben. Für sieben verschiedene CKD Ätiologien, der Unterscheidung von CKD Ätiologien Messgenauigkeiten von 0,77-0,95. Dies zeigte, dass man mittels Urinpeptidomanalyse zwischen verschiedenen CKD- Ätiologien unterscheiden kann. Die Sequenzanalyse der Biomarker ergab zudem Erkenntnisse zur Pathophysiologie der CKD Ätiologien.