Einleitung: Im Kindesalter ist das Retinoblastom (RB) der häufigste Primärtumor des Auges. Eine längere Behandlung dieser lebensbedrohlichen Erkrankung mit Chemotherapeutika wie Etoposid kann an Wirksamkeit verlieren, da die RB-Zellen eine Zytostatikaresistenz entwickeln können und folglich mit einer nachlassenden Etoposidwirkung zu rechnen ist. In dieser zellbiologischen in vitro Studie wurde untersucht, ob es Unterschiede in der Ca2+-Regulation zwischen Etoposid-sensitiven und Etoposid-resistenten RB-Zellen gibt. Methoden: Als RB-Zellmodelle wurde eine Etoposid-sensitive (WERI-Rb1) und eine Etoposid-resistente (WERI-ETOR) Zelllinie verwendet. Über Einzelzell-Fluoreszenz Calcium Imaging mit Fura-2/AM wurde die Fluoreszenzratio (f340/f380) gemessen, die proportional zur intrazellulären Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i) ist. Die Zellvitalität wurde mit Hilfe von Trypanblau-Färbungen gemessen. Ergebnisse: Die Aktivierung des Cannabinoidrezeptors 1 (CB1) über den CB1-Agonisten WIN55,212-2 (40 μM) und die Aktivierung des Transient Rezeptor Potential Melastatin 8 (TRPM8)-Kanals mit dem Kühlmittel Icilin (40 μM) führten zu einem ähnlichen Anstieg der Fluoreszenzratio (f340/f380) in beiden Zelllinien. NGF (100 ng/ml) löst dagegen in WERI-ETOR-Zellen eine stärkere Ca2+-Antwort aus als in WERI-Rb1-Zellen. Nach der Behandlung mit NGF gehen in WERI-Rb1-Zellen jedoch mehr Zellen in die Apoptose als in WERI-ETOR-Zellen. Sowohl NGF als auch WIN55-212-2 erhöhten jeweils [Ca2+]i. Eine gemeinsame Applikation bewirkte sogar einen additiven Effekt in beiden Zelllinien. In Gegenwart von NGF und WIN55,212-2 induzierte Icilin einen Ca2+-Anstieg in WERI-Rb1-Zellen, der jedoch in WERI-ETOR-Zellen vollständig unterdrückt war. Dabei konnten eine Abnahme der TRPM8-Genexpression und eine Zunahme der CB1-Expression in WERI-ETOR-Zellen beobachtet werden. Schlussfolgerung: Die Entwicklung einer Etoposid-Resistenz korreliert mit einem Anstieg der CNR1-Genexpression, die ihrerseits die TRPM8-Genexpression durch Crosstalk unterdrückt. In der Ca2+-Regulation kommt es daher in WERI-ETOR Zellen in Gegenwart von NGF zu einer Unterdrückung des TRPM8-induzierten Ca2+-Einstroms, wenn CB1 aktiviert ist. Dies unterdrückt wiederum eine durch Ca2+-Überladung induzierte Apoptose. Eine Modulation von TRPM8 in Kombination mit CB1 und NGF könnte daher ein möglicher klinischer Ansatz für die Entwicklung einer (adjuvanten) Therapie des RB bei Kindern sein. Insbesondere konnte erstmals ein möglicher Pathomechanismus beschrieben werden, der eine Etoposid-Resistenz in RB-Zellen erklären könnte.
Introduction: In childhood, retinoblastoma (RB) is the most common primary tumor of the eye. Prolonged therapeutic treatment of this life-threatening disease with chemotherapeutic agents such as etoposide may become less effective as the RB cells may develop a cytostatic resistance during treatment of this disease. Consequently, decreasing efficacy of etoposide impaired the therapeutic treatment of this disease. In this in vitro cell biological study, we investigated whether there are differences in Ca2+ regulation between etoposide-sensitive and etoposide-resistant RB cells. Methods: An etoposide-sensitive (WERI-Rb1) and an etoposide-resistant (WERI-ETOR) cell line were used as RB cell models. Fluorescence ratios (f340/f380) proportional to the intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i) were measured by single cell fluorescence calcium imaging with fura-2/AM. Cell viability was measured using trypan blue staining. Results: Activation of cannabinoid receptor 1 (CB1) by the CB1 agonist WIN55,212-2 (40 μM) and activation of the transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) channel with the cooling agent icilin (40 μM) led to a similar increase in the fluorescence ratio (f340/f380) in both cell lines. In contrast, NGF (100 ng/ml) elicits a stronger Ca2+ response in WERI-ETOR cells than in WERI-Rb1 cells. After treatment with NGF, there were more dead cells in WERI-Rb1 cells than in WERI-ETOR cells. Both NGF and WIN55-212-2 increased [Ca2+]i. However, a joint application led to an additive effect in both cell types. In the presence of NGF and WIN55,212-2, icilin induced a Ca2+ increase in WERI-Rb1 cells, which was completely absent in WERI-ETOR cells. Thereby, a decrease in TRPM8 gene expression and an increase in CB1 expression could be observed in WERI-ETOR cells. Conclusion: The development of etoposide resistance correlates with an increase in CNR1 gene expression, which in turn suppresses TRPM8 gene expression through crosstalk. Regarding Ca2+ regulation in the presence of NGF, there is a suppression of the TRPM8-induced Ca2+ influx when CB1 is activated. This in turn suppresses apoptosis induced by Ca2+ overload. A modulation of TRPM8 in combination with CB1 and NGF could be a possible clinical approach for the development of an adjuvant therapy for RB in children. Notably, a possible pathomechanism could be described for the first time, which could explain the etoposide resistance in RB cells.
