Einleitung Nierenkrankheiten tragen weltweit signifikant zu Morbidität, Mortalität und Kosten für das Gesundheitswesen bei. Limitationen in der nephrologischen Standarddiagnostik führen zu einem Bedarf an neuen Biomarkern. Die durchflusszytometrische Analyse von Urinzellen wurde bereits als vielversprechender nicht-invasiver Biomarker beschrieben. Eine zeitliche Sensitivität in der Präanalytik erschwerte die Untersuchung großer Studienpopulationen und die Implementierung in die klinische Praxis. Die Zielsetzung der Arbeit ist die Entwicklung einer neuen Methode zur Konservierung von Urinzellen, um die Zeitspanne von der Uringewinnung bis zur Laborverarbeitung zu verlängern.
Methodik In Vorversuchen wurden periphere mononukleäre Zellen des Blutes (PBMC) zu Urinproben hinzugegeben. Damit wurde der Einfluss von pH-Wert und Osmolarität auf Zellüberleben untersucht. Eine Fixierung mittels Formaldehyd wurde in verschiedenen Szenarien getestet, sowie Einflussfaktoren auf die Präzipitatbildung im Urin nach Formaldehyd-Fixierung. Formaldehydfreisetzer und Puffer wurden als weitere Konservierungsmethoden getestet. Die Validierung der entwickelten Konservierungsmethode mit Imidazolidinylharnstoff (IU) und MOPS-Puffer erfolgte anhand von 27 Patient*innenproben. Die Patienten wurden nach Grunderkrankung in verschiedene Gruppen eingeteilt, darunter Nierentransplantierte, Patienten mit Harnwegsinfektionen und Andere. Es erfolgte eine durchflusszytometrische Analyse von Leukozyten und Tubulusepithelzellen. Neben einem qualitativen Vergleich von konservierten mit frischen Proben erfolgte auch ein quantitativer Vergleich mittels statistischer Auswertung unter Nutzung des Korrelationskoeffizienten nach Pearson und t-Test.
Ergebnisse Bedingungen (pH und Osmolarität), die dem Blutplasma ähneln, verbessern das Zellüberleben. Eine zunehmende Lagerungsdauer von unfixierten Urinproben führte zu einer progressiven Verschlechterung der qualitativen und quantitativen Ergebnisse in der Durchflusszytometrie im Vergleich zu frischen Proben. Eine Formaldehyd-Fixierung der Urinproben führte zu Präzipitatbildung. Eine Konservierung von Urinproben mit Imidazolidinylharnstoff (IU) und MOPS-Puffer ermöglichte eine Verlängerung des Lagerungsintervalls auf bis zu 6 Tage. Eine Kryokonservierung verlängerte dieses Intervall auf 28 Tage.
Diskussion Die Forschungsarbeit präsentiert eine Konservierungsmethode für Urinzellen. Ohne spezifische Behandlung neigen Zellen im Urin zu Zelluntergang, was die Detektierbarkeit in der Durchflusszytometrie beeinträchtigt. Die Verwendung von Formaldehyd führte zu Präzipitatbildung, während eine Kombination von Imidazolidinylharnstoff mit MOPS-Puffer bessere Ergebnisse erzielte. Die Methode wurde an einer Patient*innen-Kohorte validiert, wobei konservierte Urinproben bis zu 6 Tage, durch Kryokonservierung bis zu 28 Tage, vor Laborverarbeitung qualitativ und quantitativ zufriedenstellende Ergebnisse lieferten.
Introduction Kidney diseases contribute significantly to morbidity, mortality, and healthcare costs worldwide. Limitations in routine nephrological work-up create a need for new biomarkers. Flow cytometric analysis of urine cells has been described as a promising non-invasive biomarker. Time-sensitivity in preanalytical logistics has hindered investigation in multi-center studies and integration into clinical practice. The aim of this study is to develop a new method for the preservation of urine cells to extend time interval from sample collection to laboratory processing.
Methodology In preliminary experiments, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were added to urine samples to investigate the influence of pH and osmolarity on cell survival. Fixation with formaldehyde was tested in various scenarios, along with factors influencing precipitate formation in urine after formaldehyde fixation. Formaldehyde releasers and buffers were tested as additional preservation methods. The developed preservation method with imidazolidinyl urea and MOPS buffer was validated using 27 patient samples. Patients were classified into different groups based on underlying conditions, including kidney transplant recipients, patients with urinary tract infections, and others. Flow cytometric analysis of leukocytes and tubular epithelial cells was conducted. In addition to a qualitative comparison of preserved and fresh samples, a quantitative comparison was performed using statistical analysis, including Pearson’s correlation coefficient and t-test.
Results Those conditions of pH and osmolarity that are similar to blood plasma enhance cell survival. Increasing storage duration of unfixed urine samples led to a progressive deterioration of qualitative and quantitative results in flow cytometry compared to fresh samples. Formaldehyde fixation of urine samples resulted in precipitate formation. Preservation of urine samples with imidazolidinyl urea (IU) and MOPS buffer allowed an extension of the storage interval to up to 6 days. Cryopreservation extended this interval to 28 days.
Discussion In this work we developed a preservation method for urine cells. Without specific treatment, cells in the urine are prone to cell death, affecting detectability in flow cytometry. The use of formaldehyde led to precipitate formation, while a combination of imidazolidinyl urea with MOPS buffer achieved better results. The method was validated in a patient cohort, demonstrating that preserved urine samples provided satisfactory qualitative and quantitative results up to 6 days, and up to 28 days with cryopreservation, before laboratory processing.
