Die Arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie (ARVC) ist eine autosomal dominant vererbte Herzmuskelerkrankung, die zu lebensbedrohlichen Herzrhythmusstörungen, plötzlichem Herztod und Herzinsuffizienz führt. Pathologisches Substrat ist der progressive Ersatz des vor allem rechtsventrikulären Myokards durch Fett- und Bindegewebe. Genetische Ursache der Erkrankung sind heterozygote Mutationen in Genen, die für desmosomale Proteine kodieren. Kardiale Desmosomen gewährleisten die mechanische Integrität von Kardiomyozyten und nehmen an wichtigen zellulären Signaltransduktionswegen teil. Das häufigste Krankheitsgen, mit 45 % aller ARVC-assoziierten Mutationen, ist Plakophilin-2 (PKP2). Die Mehrzahl der pathogenen Mutationen im Plakophilin-2 führen zu Trunkierungen des Proteins. PKP2 gehört zur Familie der Armadillo-Proteine und fungiert in kardialen Desmosomen als Verbindungsprotein zwischen den desmosomalen Cadherinen (DSG2, DSC2) und Desmoplakin (DSP). Ziel dieser Arbeit ist sowohl die Auswirkungen ARVC-assoziierter PKP2 Mutationen auf die Proteinstruktur, Stabilität und Integrität kardialer Desmosomen sowie auf zelluläre Signalwege zu untersuchen, als auch deren Einflüsse in der Pathogenese der ARVC weiter zu analysieren. Für die Überexpression rekombinant mutierter PKP2 Proteine sowie für den "knockdown" von PKP2 wurden in vitro Modellsysteme wie epitheliale Zelllinien und neonatale Kardiomyozyten verwendet. Diese Analysen wurden durch Proteinstrukturdaten ergänzt. Weiterhin wurden in vivo Expressionsanalysen desmosomaler Proteine in kardialem Patientengewebe durchgeführt sowie ein transgenes Mausmodell generiert und initial charakterisiert. Obwohl es in kardialem Patientengewebe keinen eindeutigen Hinweis für eine reduzierte PKP2 Expression gab, konnten in vitro Expressionsanalysen eindrucksvoll zeigen, dass alle untersuchten krankheitsbedingten Mutationen, unabhängig vom Mutationstyp, zur Instabilität der PKP2 Proteine führten, die vermittelt durch Calpain Proteasen, weiter degradiert wurden. Rekombinante bakterielle Expression, Kristallisierung und Strukturanalysen verschiedener mutierter PKP2 Armadillodomänen bestätigten die Instabilität und führten zur identischen Degradation in gleiche kurze Proteinfragmente, die erstmals kristallisiert ein strukturelles Modell für die Armadillodomänen des PKP2 darstellen. Zusätzlich konnte mithilfe der kardial-spezifischen Überexpression der PKP2 Mutation p.C796R im transgenen Mausmodell die in vitro beobachtete Instabilität und Degradation von PKP2 in vivo verifiziert werden. Um die Auswirkungen eines Verlustes der PKP2 Expression in primären Kardiomyozyten weiter zu analysieren, wurde PKP2 mittels siRNA ausgeschaltet. Dies resultierte in einer Auflösung des desmosomalen PKP2-DSP-Protein Kinase C-Komplexes. Die neu identifizierte kardial spezifische Isoform PKCe hyper-phosphoryliert in Abwesenheit von PKP2 die spezifischen Zielproteine Connexin 43 und die Proteinkinase AKT/PKB. Der Verlust von PKP2 führte neben der Modulation der Gap Junctions und des b-catenin Signalweges auch zu einer Reduktion der zellulären Integrität in Folge mechanischer Belastung. Zusammenfassend führen krankheitsbedingte Mutationen im PKP2 in vitro und in vivo zum Funktionsverlust durch intrinsische Instabilität und Calpain Proteasen vermittelte Degradation. Der Verlust des mutierten PKP2 Proteins resultiert in einer Destabilisierung der zellulären Integrität und führt zur Modulation intrazellulärer Signalwege, welche eine wesentliche Rolle in der Pathogenese der ARVC spielen könnten.
Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC) is an autosomal dominant cardiac muscle disorder clinically characterized by life threatening arrhythmias, sudden cardiac death and heart failure. The pathology of the disease is distinguished by degeneration of cardiac myocytes with replacement by fibrofatty and scar tissue mainly of the right ventricle. Genetically, mutations in genes encoding desmosomal proteins have been found to cause the disease. Cardiac desmosomes are known to provide mechanical integrity of adjacent cardiomyocytes and also play an important role in cellular signal transduction. The most common disease gene is plakophilin-2 (PKP2). Mutations in PKP2 have been found in about 45 % of ARVC cases. Most of the mutations lead to premature stop codons predicting truncated proteins. PKP2 belongs to the subfamily of armadillo-related proteins and maintains the link between the desmosomal cadherins (DSC2, DSG2) and desmoplakin (DSP). The objective of this thesis is to determine the effects of ARVC related PKP2 mutations on protein structure, stability and intercellular junction pathology as well as cellular signal transduction and their consequences in the pathogenesis of ARVC. Therefore in vitro cell culture systems such as epithelial cell lines and neonatal rat cardiomyocytes have been used to over-express certain PKP2 mutations and knockdown PKP2 via siRNA. This was complemented by structural analyses of mutant PKP2 proteins. Furthermore in vivo expression analyses of desmosomal proteins in cardiac tissue of patients have been performed as well as a transgenic mouse model was generated and initially characterized. Although in cardiac tissue of patients the reduction of PKP2 expression was not consistent, all in vitro expression studies of different mutant PKP2 proteins consistently revealed their instability following proteolytic degradation by calpain proteases. Bacterial expression, crystallization and structural modeling of mutated proteins impacting different Arm domains and helices of PKP2 confirmed their instability and degradation, resulting in the same remaining protein fragment which was crystallized and used to model the entire Arm domain of PKP2. The analysis of a transgenic mouse model overexpressing the p.C796R mutation in the heart verified the instability and degradation of the mutant PKP2 protein in vivo. In order to analyze the consequences due to loss of PKP2, neonatal rat cardiomyocytes were treated with siRNA which resulted in disintegration of the desmosomal complex consisting of PKP2, DSP and protein kinase C. Interestingly, in absence of PKP2 the newly identified cardiac specific isoform PKCe hyper-phosphorylated specific targets such as connexin 43 and AKT/PKB. In addition, loss of PKP2 resulted not only in gap junction remodelling and influencing the beta-catenin and AKT signalling pathway, but also in a decreased cellular integrity after mechanical stress. In summary, disease causing PKP2 mutations suggest loss of function effects by intrinsic instability and calpain proteases mediated degradation in in vitro and in vivo model systems. Loss of PKP2 results in destabilization of cellular integrity and modulates intracellular signaling pathways; both might play a significant role in the pathogenesis of ARVC.
