Owing to the limited availability of therapeutic strategies addressing VC and the substantial number of affected patients, a clinical demand persists for pharmaceutical interventions capable of hindering, decelerating, or potentially reverse the onset of VC. Therefore, the vascular scientific community works to shed light on the underlying molecular mechanism with the final aim of developing new predicting clinical markers. New tools are needed to make the screening of potential therapeutic targets not only better adaptable to different experimental settings but also more compliant with the 3Rs principles, the pillars of ethical conduct in biomedical research. Enhancing the specificity and high-throughput applicability of VC detection assays is the main purpose of this work which was executed with the additional aim to downscale the number of sacrificed animals. To reach such goals here is developed a novel protocol for the detection of HAP in ex vivo rat tissue and in primary VSMC in vitro employing the HAP- specific probe OS™. To verify the reliability of the newly developed method, the results were compared to those obtained via canonical pre-existing assays such as the photometric detection of calcium content and Alizarin Red S staining within both cells and tissue. To address the ethical question orbiting around animal burden the in vitro segment of this work was further tested using an alternative immortalized vascular cell line MOVAS. Despite all the evidence supporting a role for the Nlrp3 inflammasome in VC its functioning upon calcification or environmental stressors milieu is yet to be fully explained. Therefore, in the terminal part of this research, we aim to investigate the activation of NRLs during VC and premature senescence upon stimulation with an immunosuppressive stressor addressed by the commercial name of DOX (or Adriamycin). The principle that this part of the project aims to demonstrate is that stressor-induced senescence in VSMC leads to a pro-inflammatory response mediated by the Nlrp3 inflammasome with a subsequent increase in senescence signalling and the overall amount of VC. To do so ROS, DNA damage and inflammation were induced in rat VSMC and thoracic aorta via DOX, with ultimate evaluation of both senescence and calcification.
Hintergrund: Die vaskuläre Kalzifizierung (VC) ist eine systemische Störung der Gefäße, bei der es zu einer Ablagerung von Hydroxyapatit (HAP) in der Gefäßwand kommt. Neben verschiedenen Mediatoren und Inhibitoren, ist die chronische Nierenkrankheit (CKD) ein wichtiger Risikofaktor. Derzeit fehlen robuste therapeutische Ansätze. Um die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen zu untersuchen, optimierte experimentelle Methode sind notwendig. Das Zeil dieser Studie ist es, ein schnelles und zuverlässiges Arbeitsprotokoll zur spezifischen HAP- Detektion in primären und sekundären Zelllinien sowie Geweben unter Verwendung des fluoreszierenden Farbstoffs OsteoSense™680 EX (OSTM) zu etablieren. Des Weiteren wurden zentrale Signalwege in der VC Pathogenese in vitro und ex vivo charakterisiert. Methoden: Ein hochphosphathaltiges Medium diente als positiv Kontrolle zur Induktion von VC in vitro und ex vivo. Das Ausmaß der HAP Ablagerung und Seneszenz wurde durch Färbung mittels OSTM und γ-H2A.x-spezifischem Antikörper bewertet. Ergebnisse: OSTM war in der Lage, Mikro- und Makroverkalkungen ex vivo und in vitro auf Einzelzellebene spezifisch anzufärben. Das Protokoll ermöglichte eine Multiplex- Färbung sowie den Nachweis von VC in einem CKD-Tiermodell. Darüber hinaus konnte eine Rolle der stressinduzierten Entzündung bei der Auslösung von VC über das Nlrp3-Inflammasom aufgezeigt werden. Schließlich zeigte MOVAS Unterschiede in der Genexpression von CKD-Markern während des Alterungsprozesses, was die Zuverlässigkeit seiner Langzeitanwendung bei der Verwendung von immortalisierten Zellen in vaskulären Experimenten in Frage stellt. Schlussfolgerungen: OSTM ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Erkennung früher subtiler osteogener Aktivitäten im Gefäßsystem und zeigt in dieser Arbeit sein Potenzial zur Verbesserung von Verkalkungstests. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um zu zeigen, für welche experimentellen Ansätze MOVAS eine geeignete Alternative darstellen könnten, um primäre Zellen zumindest teilweise zu ersetzen. So könnte ein wichtiger Beitrag im Sinne des 3Rs-Prinzips von Russel und Burch zur Verbesserung tierexperimeteller Forschung zu leisten. Die Blockierung der Inhibition der pattern recognition receptors (PPRs) könnte eine therapeutische Strategie zur Behandlung systemischer Gefäßerkrankungen sein.
