Zellkulturmodelle der humanen Haut und Schleimhaut sind wichtige Instrumente der präklinischen Forschung, z.B. für die Erweiterung der Kenntnisse über physiologische und pathologische Prozesse auf Zellebene oder für die Testung pharmakologischer Substanzen. Die Verwendbarkeit von primären Epithelzellen ist jedoch begrenzt durch die progrediente Abnahme der Proliferation, ihre zunehmende Differenzierung und schließlich den Eintritt in die Seneszenz. Daher wurde eine Vielzahl von Methoden entwickelt, um die Kultivierung von primären Keratinozyten zu optimieren, z.B. die Isolierung epithelialer Stammzellen oder die Beeinflussung von Proliferation und Differenzierung mittels Rho-Kinase-Inhibitoren. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der xenogenfreien Kultur von immortalisierten und primären Keratinozyten aus humaner Mundschleimhaut. Es wurde die in vitro-Expression der etablierten Stammzellmarker Integrin α₆, Integrin β₁, CD71 (Transferrin Rezeptor), p75 (Neurotrophin Rezeptor) und Cytokeratin 5 mittels FACS analysiert. Zusätzlich wurde der Einfluss des Rho-Kinase-Inhibitors Y27632 auf das Wachstum, die Morphologie sowie die Expression der Stammzellmarker untersucht. Schließlich wurde versucht, mittels repetitiver Filtration eine stammzellähnliche Population zu selektieren und zu erhalten. Die Expression der untersuchten Stammzellmarker in kultivierten Keratinozyten unterschied sich deutlich von dem beschriebenen Expressionsmuster in vivo. Integrin α₆, Integrin β₁, CD71 und Cytokeratin 5 wurden von fast 100% der adhärent kultivierten Keratinozyten exprimiert, während p75 nur bei einer Teilpopulation nachweisbar war. Nach Induktion der Differenzierung durch Anhebung der Calciumkonzentration im Kulturmedium und nach Zugabe des Rho-Kinase-Inhibitors Y27632 zeigten sich keine wesentlichen Veränderungen der Expression. Die Induktion der Differenzierung in Suspension hingegen führte zu einem raschen Verlust aller Stammzellmarker. Die Kultivierung mit dem Rho-Kinase-Inhibitor Y27632 führte allein und insbesondere in Kombination mit der repetitiven Zellfiltration zu einer signifikanten Verbesserung der Langzeit-Proliferation einer Keratinozytenpopulation sowie zum Erhalt einer undifferenzierten Zellmorphologie, jedoch nicht zur Immortalisierung der Zellen. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass sich die Expression von Stammzellmarkern von gingivalen Keratinozyten in vitro im Vergleich zu Keratinozyten in vivo stark verändert und dass eine Selektion von epithelialen Stammzellen anhand des in vivo beschriebenen Expressionsmusters aus einer zweidimensional kultivierten Population nicht möglich ist. Die Kultivierung in Gegenwart des Rho-Kinase-Inhibitors Y27632 und die repetitive Zellfiltration hingegen verbessern die proliferativen Eigenschaften primärer Keratinozyten in vitro und stellen damit einfach anwendbare Methoden zur Anreicherung von stammzellähnlichen Epithelzellen dar, die für weiterführende Experimente verwendet werden können.
Cell culture models of the human skin and mucosa are important tools in preclinical studies, for example to amplify the knowledge about physiological and pathophysiological processes in keratinocytes or to test new pharmacological substances. The use of primary epithelial cells is however limited by a constant decrease of their proliferation, their increasing differentiation and finally the senescence of all cells. To address these problems, many different methods have been developed to improve the culture conditions for primary keratinocytes, for example the isolation and selective culture of epithelial stem cells or the conditional reprogramming with Rho-kinase inhibitors. The present study reports on the xenogen-free cell culture of immortalized and primary keratinocytes of the human gingiva. The expression of the established stem cell markers Integrin α₆, Integrin β₁, CD71 (Transferrin receptor), p75 (Neurotrophin receptor) and Cytokeratin 5 in cultured cells was analysed by flow cytometry. Furthermore, the influence of the Rho-kinase inhibitor Y27632 on proliferation, cell morphology and the expression of the stem cell markers in keratinocytes was investigated. Finally, we aimed to isolate and preserve a population of putative stem cells by repetitive cell filtration. The expression of the tested stem cell markers in the cultured keratinocytes clearly differed from the expression described for keratinocytes in vivo. Integrin α₆, Integrin β₁, CD71 and CK5 were expressed by nearly 100% of the adherent cultured cells, while p75 was detectable only in a small number of keratinocytes. Inducing the differentiation by increasing the calcium concentration of the cell culture medium or adding the Rho-kinase inhibitor Y27632 to the medium did not result in any significant change of the expression. However, the percentage of keratinocytes expressing stem cell markers decreased significantly when differentiation was induced by suspension culture. The addition of the Rho-kinase inhibitor Y27632 alone and especially in combination with the repetitive filtration significantly improved the long-term growth capacity and preserved an undifferentiated morphology of the cells, but was not able to immortalize the cell population. In conclusion this study shows, that the expression of the tested stem cell markers in human oral keratinocytes changes significantly when transferred from in vivo to cell culture. Hence, the isolation of epithelial stem cells from a population of two-dimensionally cultured keratinocytes based on the expression of the stem cell markers described in vivo is not possible. However, culturing keratinocytes in presence of the Rho-kinase inhibitor Y27632 and with repetitive cell filtration are simple methods to expand epithelial cells with stem cell properties, that subsequently can be used to establish adequate cell culture models and for further experiments.
