Traditionally, hydrostatic lung edema has been attributed exclusively to an imbalance in Starling forces, i.e. increased fluid filtration due to an imbalance of hydrostatic and oncotic pressure gradients across the lung microvascular barrier. This classical view has been challenged by recent findings demonstrating an active regulation of lung microvascular permeability in hydrostatic stress, suggesting that endothelial responses may contribute critically to formation of hydrostatic lung edema. Here, we combined real-time optical imaging of endothelial responses, in particular changes in the endothelial Ca2+ concentration ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO) synthesis, in intact lungs with measurements of lung vascular filtration coefficient (Kf) as a measure of lung microvascular water permeability. By these approaches, we identified a series of endothelial responses to hydrostatic stress that constitute a negative feedback loop which protects the pulmonary vascular barrier. We demonstrate that hydrostatic stress stimulates endothelial Ca2+ entry by activation of mechanosensitive cation channels. The resulting increase in endothelial [Ca2+]i increases Kf by activation of myosin light- chain kinase and simultaneously stimulates endothelial NO production by activation of endothelial NO synthase. In subsequent experiments, we could identify the transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) channel as mechanosensitive cation channel which mediates the endothelial [Ca2+]i response to hydrostatic stress. Consistent with this notion, we found pressure-induced increases in endothelial [Ca2+]i, NO synthesis, as well as lung wet/dry weight ratio to be markedly attenuated in TRPV4-/- mice. Notably, endothelial NO formation was shown to limit the permeability increase via a cGMP-dependent attenuation of the pressure-induced [Ca2+]i response. Inactivation of TRPV4 channels by cGMP was confirmed by whole-cell patch-clamp of pulmonary microvascular endothelial cells and intravital imaging of endothelial [Ca2+]i. Hence, pressure-induced endothelial Ca2+ influx via TRPV4 channels increases lung vascular permeability, yet concomitantly activates an NO-mediated negative-feedback loop that protects the vascular barrier by a cGMP-dependent attenuation of endothelial [Ca2+]i response. Identification of this novel regulatory pathway gives rise to new treatment strategies, as demonstrated in vivo in rats with acute myocardial infarction that inhibition of cGMP degradation by the phosphodiesterase 5 inhibitor sildenafil reduced hydrostatic lung edema. In a model of chronic pulmonary hydrostatic stress due to congestive heart failure, inhalation of NO was shown to markedly reduce lung wet/dry weight ratios. Similarly, long-term application of sildenafil protected lung vascular barrier function and reduced lung edema. Hence, negative feedback regulation of TRPV4 via NO/cGMP signaling in lung endothelial cells presents a novel signaling cascade and a promising therapeutic strategy for the treatment of hydrostatic lung edema.
Traditionell wurde die Entstehung des hydrostatischen Lungenödems ausschließlich einem Ungleichgewicht der Starling´schen Kräfte, d.h. einer vermehrten Flüssigkeitsfiltration aufgrund eines Ungleichgewichts der hydrostatischen und onkotischen Druckgradienten über die Wand der pulmonalen Mikrogefäße, zugeschrieben. Diese klassische Sichtweise wurde durch die Ergebnisse jüngerer Untersuchungen in Frage gestellt, in denen eine aktive Regulation der mikrovaskulären Permeabilität bei hydrostatischem Stress nachgewiesen wurde, was auf eine wesentliche Rolle endothelialer Regulationsmechanismen in der Pathogenese des hydrostatischen Lungenödems hinweist. In unseren Untersuchungen haben wir optische Bildgebungsverfahren zur Visualisierung endothelialer Reaktionen, insbesondere von Änderungen der endothelialen Ca2+ Konzentration ([Ca2+]i) und der Synthese von Stickstoffmonoxid (NO), in der intakten Lunge mit Messungen des vaskulären Filtrationskoeffizienten (Kf) als Maß der pulmonalvaskulären Flüssigkeitspermeabilität kombiniert. Mit Hilfe dieses Ansatzes konnten wir eine endotheliale Reaktionen auf hydrostatischen Stress identifizieren, die in Form eines negativen Rückkopplungsmechanismus die pulmonale Gefäßbarriere schützen. Unsere Untersuchungen zeigen, dass hydrostatischer Stress den endothelialen Einstrom von Ca2+ durch Aktivierung mechanosensitiver Kationenkanäle stimuliert. Der resultierende endotheliale [Ca2+]i Anstieg führt durch Aktivierung der Myosin-Leichtkettenkinase zu einem Anstieg von Kf und stimuliert zugleich die endotheliale NO Produktion durch Aktivierung der endothelialen NO Synthase. In nachfolgenden Experimenten konnten wir den transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) Kanal als mechanosensitiven Kationenkanal, der den endothelialen [Ca2+]i Anstieg bei hydrostatischem Stress vermittelt, identifizieren. Entsprechend wiesen TRPV4-/- Mäuse eine deutliche Abschwächung des endothelialen [Ca2+]i Anstiegs, der NO Produktion und des Lungenödems bei hydrostatischem Stress auf. Endothelial-gebildetes NO minderte den Anstieg der vaskulären Permeabilität über eine cGMP-abhängige Abschwächung der endothelialen [Ca2+]i Antwort. Nachfolgende Patch-clamp Untersuchungen pulmonaler mikrovaskulärer Endothelzellen sowie intravitales Imaging des endothelialen [Ca2+]i bestätigten die Inaktivierung von TRPV4 durch cGMP. Demzufolge steigert der Druck-induzierte Ca2+ Einstrom über TRPV4 Kanäle die pulmonalvaskuläre Permeabilität, aktiviert aber zugleich einen NO- vermittelten Rückkopplungsmechanismus, der die Gefäßbarriere durch eine cGMP- abhängige Hemmung der endothelialen [Ca2+]i Antwort schützt. Die Identifizierung dieses neuen regulatorischen Signalweges bietet Ansätze für neue Behandlungsstrategien. So konnten wir in der vorliegenden Arbeit in einem Modell des akuten Myokardinfarkts eine deutliche Abnahme des Lungenödems durch Hemmung der cGMP Hydrolyse mittels des Phosphodiesterase 5 Hemmers Sildenafil erzielen. In einem Modell chronischen hydrostatischen Stresses infolge einer Herzinsuffizienz konnte durch Inhalation von NO ebenfalls eine Abnahme des Lungenödems erzielt werden. Desgleichen verbesserte eine Dauertherapie mit Sildenafil in diesem Modell die mikrovaskuläre Barrierefunktion und reduzierte das Lungenödem. Die Regulation des mechanosensitiven TRPV4 Kanals durch einen negativen Rückkopplungsmechanismus über NO und cGMP stellt folglich einen neuen intrazellulären Regulationsweg und eine vielversprechende therapeutische Strategie für die Behandlung des hydrostatischen Lungenödems dar.
