Neurotransmitter release via synaptic vesicle fusion is essential for fast and reliable neurotransmission in chemical synapses. This process is mediated by the soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor (SNARE) complex, composed of Syntaxin-1 (Stx1), Synaptobrevin-2 (Syb2), and Synaptosome-associated protein 25 kDa (SNAP-25), and is further orchestrated by key regulator proteins such as Munc18-1 and Munc13-1. Mutations in SNARE and regulatory proteins are associated with a group of neurological disorders known as SNAREopathies, which present with a range of phenotypes from cognitive impairments to epilepsy. In this work, we investigate the molecular impact of two clinically significant mutations in Syntaxin-1B (Stx1B), E210K and L221P, both of which are associated with distinct epilepsy phenotypes. Despite their clinical relevance, the molecular mechanisms by which these mutations disrupt proper neurotransmission have remained unclear. Our findings reveal that the Stx1BE210K mutant primarily affect the interaction to Munc18-1. The mutation introduces charge repulsion between the Habc domain and the SNARE motif of Stx1B, altering the conformation and significantly reducing its binding affinity to Munc18-1. This alteration can be rescued by charge reversion of the opposing K82 side chain in the Habc domain (Stx1BE210K,K82E), restoring interaction almost to wild type level. In contrast, the L221P mutation directly compromises the structural integrity of the SNARE motif in Stx1B. The substitution of proline affects the helicity of Stx1B, SNARE complex stability and significantly reducing the efficiency and velocity of liposome fusion in vitro. The distinct molecular effects of these two mutations demonstrate how specific alterations within the same SNARE motif can lead to diverse pathophysiological outcomes. In vivo experiments, performed in collaboration with the University of Oslo, using zebrafish models expressing human Stx1B wild-type and mutant constructs display an increased number and duration of seizure events in the mutants, as measured by local field potential recordings. Additionally, the E210K mutant exhibits an impaired touch response. Importantly, both the seizure activity and the altered touch response by Stx1BE210K were rescued in zebrafish expressing the charge-reversion rescue mutant Stx1BE210K,K82E, which partially restored normal local field potential patterns and behavioral responses. These results suggest that the molecular alterations in SNARE complex formation and function are directly linked to the epileptic phenotypes observed in vivo. Additionally, we investigate the interaction of Syb2 with its regulatory partners, Munc18-1 and the MUN domain of Munc13-1, which are crucial for aligning and stabilizing the SNARE motifs of Stx1 and Syb2, ensuring proper SNARE complex assembly. Our findings confirm that Syb2’s juxtamembrane domain (JMD) binds to the C-terminal region of the MUN domain of Munc13-1, with both tryptophan residues in the JMD acting as anchor points. Additionally, cross linking mass spectrometry revealed that the SNARE motif of Syb2 aligns with the concave side of the MUN domain, and an additional binding site for Syb2 was identified in domain 1 of Munc18-1.
Die Freisetzung von Neurotransmittern durch synaptische Vesikelfusion ist entscheidend für eine schnelle und zuverlässige Neurotransmission in chemischen Synapsen. Dieser Prozess wird durch den löslichen N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor (SNARE)-Komplex vermittelt, bestehend aus Syntaxin-1 (Stx1), Synaptobrevin-2 (Syb2) und dem Synaptosome associated protein 25 kDa (SNAP-25). Die Bildung des SNARE-Komplexes wird von Regulatorproteinen wie Munc18-1 und Munc13-1 gesteuert. Mutationen in SNARE- und Regulatorproteinen sind mit einer Gruppe neurologischer Erkrankungen verbunden, die als SNAREopathien bekannt sind und von kognitiven Beeinträchtigungen bis hin zu Epilepsie reichen. In dieser Arbeit untersuchen wir die molekularen Auswirkungen der klinisch relevanten Syntaxin-1B (Stx1B)-Mutationen E210K und L221P, die mit unterschiedlichen Epilepsie-Phänotypen assoziiert sind. Trotz ihrer klinischen Bedeutung sind die molekularen Mechanismen, durch die diese Mutationen die korrekte Neurotransmission stören, bislang unklar geblieben. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Stx1BE210K-Mutante hauptsächlich die Interaktion mit Munc18-1 stört. Die Mutation verursacht eine Ladungsabstoßung zwischen der Habc-Domäne und dem SNARE-Motiv, was die Konformation verändert und die Bindungsaffinität zu Munc18-1 signifikant reduziert. Diese Beeinträchtigung kann durch eine Ladungsumkehr der gegenüberliegenden K82-Seitenkette (Stx1BE210K,K82E) nahezu vollständig behoben werden. Im Gegensatz dazu beeinträchtigt die L221P-Mutation die strukturelle Integrität des SNARE-Motivs. Die Prolin-Substitution beeinflusst die Helizität von Stx1B, was die Stabilität des SNARE-Komplexes verringert und die Effizienz und Geschwindigkeit der in vitro-Liposomenfusion signifikant reduziert. Die unterschiedlichen molekularen Auswirkungen dieser beiden Mutationen zeigen, wie spezifische Veränderungen innerhalb desselben SNARE-Motivs zu vielfältigen pathophysiologischen Ergebnissen führen können. In vivo-Experimente mit Zebrafischen, die humane Stx1B-Wildtyp- und Mutantenkonstrukte exprimierten, durchgeführt in Zusammenarbeit mit der Universität Oslo, zeigen bei den Mutanten eine erhöhte Krampfaktivität und -dauer, gemessen anhand der lokalen Feldpotenziale. Zudem weist die E210K-Mutante eine beeinträchtigte Berührungsreaktion auf. Diese Effekte werden durch die Rettungsmutante Stx1BE210K,K82E abgeschwächt, wodurch normale Feldpotenziale und Verhaltensreaktionen teilweise wiederhergestellt werden konnten. Des Weiteren untersuchen wir die Interaktion von Syb2 mit Munc18-1 und der MUN-Domäne von Munc13-1, die für die Ausrichtung und Stabilisierung der SNARE-Motive entscheidend sind. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die juxtamembrane Domäne (JMD) von Syb2 an die C-terminale Region der MUN-Domäne bindet, wobei die beiden Tryptophanreste als Ankerpunkte fungieren. Zudem zeigen Crosslinking-Massenspektrometrie-Experimente, dass sich das SNARE-Motiv von Syb2 an der konkaven Seite der MUN-Domäne ausrichtet, und wir identifizierten eine zusätzliche Bindungsstelle für Syb2 in Domäne 1 von Munc18-1.
