The deposition of misfolded proteins in inclusion bodies of patient brains has been recognized as a common pathological hallmark of a large number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease (PD) and polyglutamine (polyQ) diseases, such as Huntington’s disease (HD). Increasing experimental evidence indicates that conformational changes in disease proteins that precede aggregation are critical for pathogenesis in protein misfolding disorders. Despite the distinct primary amino acids of disease-causing proteins, the insoluble protein aggregates share a common characteristic, namely that they are β-sheet-rich amyloid fibrils. A better understanding of the molecular mechanism of how amyloid aggregates are formed in vitro and in vivo is of high importance for disease research and the development of therapies against amyloid diseases. Several lines of evidence indicate that polyQ tracts in N-terminal huntingtin (Htt) fragments promote their aggregation into insoluble β-sheet-rich fibrillar aggregates. In this study, the spontaneous self-assembly of Htt-exon 1 fragments with a pathogenic polyQ tract of 49 glutamines (Ex1Q49) was systematically analyzed using time- resolved amyloid polymerization assays and epitope-specific antibodies, to show that early conformational changes in the polyQ tract of Ex1Q49 control the onset of spontaneous amyloid polymerization. Stabilizing a distinct polyQ conformation specifically recognized by the monoclonal antibody 3B5H10 through the action of a small molecule (O4) delays the onset of Ex1Q49 amyloidogenesis, indicating that formation of this polyQ structure is a prerequisite for efficient amyloid assembly. The importance of these observations was emphasized by comprehensive mathematical modeling studies. Based on the data the model predicts that β-sheet-rich Ex1Q49 amyloid fibrils are spontaneously formed by a prion-like autocatalytic process. Deletion of 15 N-terminal amino acids in the Htt-exon 1 fragment reduces the rate of spontaneous amyloid polymerization without changing the mechanism of aggregation. The results suggest that the N-terminus enhances nucleus formation by forming intramolecular interactions or by promoting intermolecular interactions with other monomers. Treatment of cells with the compound O4 increases the relative amount of soluble Htt molecules with exposed polyQ tracts that can be recognized by the anti-polyQ antibodies 3B5H10 and MW1. 3B5H10 has been shown before to recognize a toxic Htt conformation in cells. However, no increase in polyQ-induced toxicity was observed in O4 treated SH-EP cells expressing a Htt-exon 1 fragment with 73 glutamines fused to YFP, indicating that soluble Htt proteins with exposed polyQ tracts are non-toxic for mammalian cells. Taken together, the experimental and theoretical studies provide a basis for a better understanding of the molecular mechanism by which expanded polyQ tracts promote the spontaneous polymerization of Htt fragments. In addition, the results might help to develop therapeutic small molecules that target different events in the Htt amyloid assembly process.
In Gehirnen von Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen wurden Ablagerungen von fehlgefalteten Proteinen in neuronalen Einschlüssen gefunden, die als ein gemeinsames pathologisches Merkmal angesehen werden können. Zu diesen Krankheiten gehören die Alzheimer Erkrankung, die Parkinson Erkrankung und die Polyglutaminerkrankungen, zu denen auch Chorea Huntington zählt. Experimentelle Ergebnisse weisen darauf hin, dass Konformationsänderungen in löslichen amyloiden Proteinen, die der Aggregation voraus gehen, kritisch für den Verlauf der Pathogenese bei Fehlfaltungskrankheiten sind. Obwohl diese Proteine unterschiedliche Aminosäuresequenzen aufweisen, haben die gebildeten unlöslichen Proteinaggregate gemeinsame Charakteristika. Amyloidogene Proteine aggregieren zu fibrillären Aggregaten mit einem hohen Anteil an β-Faltblattstrukturen. Ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen wie Amyloidaggregate in vitro und vivo gebildet werden, ist äußerst wichtig für die Krankheitsforschung und für die Entwicklung von neuen Therapien zur Behandlung von Proteinfehlfaltungs-Erkrankungen. Es gibt eine Vielzahl von Anhaltspunkten, die darauf hindeuten, dass die Polyglutamin-Domäne in N-terminalen Huntingtin (Htt) Fragmenten für die Aggregation der Proteine in unlösliche fibrilläre Aggregate verantwortlich ist. In dieser Arbeit wurde die spontane Aggregation eines Htt Exon 1 Fragments mit 49 Glutaminen (Ex1Q49) systematisch untersucht. Dazu wurden Zeit-aufgelöste Polymerisationsversuche durchgeführt und Epitop-spezifische Antikörper eingesetzt, um zu zeigen, dass frühe Konformationsänderungen in der polyQ-Domäne von Ex1Q49 den Beginn der Aggregation kontrollieren. Die Stabilisierung einer spezifischen Polyglutamin- Konformation durch die Wirkung des kleinen Moleküls O4 konnte mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers 3B5H10 nachgewiesen werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass durch die Stabilisierung dieser Polyglutamin-Konformation die Bildung von unlöslichen Ex1Q49 Aggregaten verzögert wird. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass die Bildung dieser Polyglutamin-Konformation eine Voraussetzung dafür ist, dass das Ex1Q49 Protein effizient in amyloide Strukturen polymerisieren kann. Die Wichtigkeit dieser biochemischen Ergebnisse wurde durch mathematische Modellierung des Aggregationsprozesses unterstützt. Das Modell sagt voraus, dass ein autokatalytischer Prozess für die spontane Bildung von fibrillären Ex1Q49 Aggregaten verantwortlich ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass durch die Deletion von 15 N-terminalen Aminosäuren im Ex1Q49 Protein (ΔN15Ex1Q49) die spontane Proteinaggregation dramatisch verlangsamt wird. Durch die Behandlung von Zellen mit der Substanz O4 konnte die relative Menge an Ex1Q49 Molekülen, die mit den Polyglutamin- spezifischen Antikörpern 3B5H10 und MW1 erkannt werden, erhöht werden. Die Untersuchungen deuten darauf hin, dass lösliche Htt Proteine mit einer für Antikörper zugänglichen Polyglutaminsequenz für Zellen nicht toxisch sind. Die Ergebnisse erlauben ein besseres Verständnis des molekularen Mechanismus der spontanen Polyglutamin-vermittelten Polymerisation von N-terminalen Htt- Fragmenten. Außerdem helfen sie neue Substanzen zu finden, die die Selbstassoziation von mutierten Htt Fragmenten beeinflussen.
