Zur Untersuchung von Phospholipase C (PLC)-Aktivierung in einzelnen lebenden Zellen wurden Fusionsproteine aus GFP-Varianten und solchen Proteinen eingesetzt, deren subzelluläre Lokalisation durch ihre Interaktion mit PLC- abhängig gebildeten oder abgebauten Signalmolekülen bestimmt wird: die neuartige Proteinkinase C (PKC)-Isoform PKC-epsilon, die durch Bindung an Diacylglycerol (DAG) vom Cytosol an die Plasmamembran transloziert, die klassische Isoform PKC-alpha, die zusätzlich auch Calcium-abhängig transloziert, sowie die Pleckstrin-homologe Domäne der PLC-delta1 (PLC- delta1-PH), die an das PLC-Substrat Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphat (PIP2) und an das lösliche PLC-Produkt Inositol-1,4,5-Trisphosphat (InsP3) bindet. Calcium-Oszillationen können entweder durch zyklische PLC-vermittelte InsP3-Bildung oder durch repetitive Calcium-Freisetzung bei konstanter InsP3-Konzentration generiert werden. Den Carbachol-induzierten Calcium- Oszillationen in HEK293-Zellen liegt eine konstante, nicht-oszillatorische PLC-Aktivierung zugrunde: Synchron mit den Calcium-Anstiegen translozierte PKC-alpha vom Cytosol an die Plasmamembran und zurück, wobei Hin- und Rückverteilung gleich schnell waren, was sich durch einen diffusionsgetriebenen, Calcium- aber nicht DAG-abhängigen Translokationsmechanismus erklären lässt. PLC-delta1-PH blieb dabei an der Plasmamembran lokalisiert, und PKC-epsilon vollführte eine monophasische, mehrere Calcium-Transienten überdauernde Translokation an die Plasmamembran und zurück. Nach maximaler PLC-Stimulation zeigten alle drei Indikatoren eine PLC-Aktivierung an: PLC-delta1-PH und PKC-epsilon vollführten gegenläufige Translokationen, während PKC-alpha nach einer schnellen Translokation an die Plasmamembran eine durch DAG-Bindung verzögerte Rückverteilung ins Cytosol zeigte. Der Ionenkanal TRPC4 zeigte ein spannungsabhängiges Schaltverhalten, das durch PLC-Aktivierung moduliert wird: Parallel zu einer rezeptorvermittelten PLC-Aktivierung entwickelten sich in TRPC4 exprimierenden Zellen zunächst Auswärtsströme bei positivem, dann auch Einwärtsströme bei negativem Membranpotential. Die Strom-Spannungs-Kennlinien zeigten dabei eine durch PLC-Aktivität induzierte Verschiebung der Offenwahrscheinlichkeit in Abhängigkeit vom Membranpotential in Richtung negativer Potentiale. Außerdem führte PLC-Aktivierung zu einer Beschleunigung der Aktivierungs- und einer Verlangsamung der Deaktivierungskinetik des Stromes. Eine im Rahmen von Vorarbeiten aufgefallene Instabilität der Fluoreszenz häufig verwendeter GFP- Farbvarianten konnte auf ein bisher nicht beschriebenes reversibles Ausbleichen zurückgeführt werden: Nach Anregung der protonierten Form der fluoreszierenden Proteine kommt es zur Ausbildung eines nicht fluoreszierenden Zustands verminderter Absorption. Die reversibel ausgebleichten fluoreszierenden Proteine erlangen ihre Fluoreszenz mit Zeitkonstanten im Bereich einiger Sekunden spontan zurück, außerdem ist eine Beschleunigung der Reaktivierung durch Belichtung möglich.
Fusion proteins between GFP color variants and proteins that localize to specific subcellular compartments due to their interaction with PLC substrates or products were used as fluorescent single-cell biosensors to investigate PLC signalling in single living cells: the novel proteinkinase C (PKC) isoform PKC-epsilon that translocates from the cytosol to the plasma membrane upon binding to diacylglycerol (DAG), the classical isoform PKC-alpha, that additionally translocates in a calcium-dependent manner, and the pleckstrin homology domain of PLC-delta1 (PLC-delta1-PH), that binds to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) in the plasma membrane as well as to the soluble inositol-1,4,5-trisphosphate (InsP3). Calcium oscillations can arise either from cyclic PLC-mediated InsP3 generation or from repetitive calcium release at a constant InsP3 concentration. The carbachol-induced calcium oscillations in HEK293 cells develop at a constant, non-oscillatory level of PLC activity: in synchrony with the repetitive calcium transients, repetitive translocations of PKC-alpha from the cytosol to the plasma membrane and back were observed. The translocations back to the cytosol were as fast as the translocations to the plasma membrane, which may be explained by diffusion being the driving mechanism of both translocations. PLC-delta1-PH remained at the plasma membrane, and PCK-epsilon performed a monophasic translocation to the plasma membrane and back to the cytosol enduring several calcium transients. After maximal stimulation of PLC-activating receptors, all the three fusion proteins indicated PLC activation: PLC-delta1-PH and PKC-epsilon performed antiparallel translocations, while the redistribution of PKC-alpha to the cytosol was delayed by DAG binding. The ion channel TRPC4 was shown to exhibit voltage-dependent gating which is modulated by PLC activation: In parallel with a receptor-mediated activation of PLC, outward currents at positive membrane potential developped in TRPC4-expressing cells, followed by inward currents at negative membrane potential. The current-voltage- relationships indicate a PLC-mediated shift of the voltage-dependent open probability towards more negative potentials. Moreover, PLC activation increases the rate constant for activation and decreases the rate constant for deactivation of the current. An instability of the fluorescence level of frequently used GFP color variants that was obvious in preliminary experiments was demonstrate to arise from a yet undescribed reversible photobleaching: after excitation of the protonated state of the fluorescent proteins, a non- fluorescent state with a reduced absorbance is generated. The reversibly bleached proteins spontaneously regain their fluorescence with time constants in the range of several seconds. In addition, an acceleration of this re- activation may be caused by illumination.
