Campylobacter jejuni and Campylobacter coli are considered the primary causative agents of campylobacteriosis in humans, which has significant public health implications worldwide. In Europe, they account for by far the most cases of bacterial gastroenteritis. Particularly feared, though underestimated by the general population, are the long-term consequences of an infection that can occur in rare cases, such as Guillain-Barré syndrome, reactive arthritis, and irritable bowel syndrome. The excessive use of antibiotics in human and veterinary medicine has led to increasing resistance of these bacteria to antimicrobial agents, limiting treatment options. Consequently, the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) classifies Campylobacter, especially due to its fluoroquinolone resistance, as a high-priority resistant bacterium and a serious public health threat. This study aimed to compare the antibiotic resistances of Campylobacter isolates from different regions of the world to identify resistance determinants relevant to human medicine and imminent in Europe, which develop under high selection pressure and pose a challenge to global public health. Based on the results of this comparative study, a novel warning tool should be developed that can be used at the molecular level in routine monitoring programs. The results of our comparative study showed differences in the extent of various resistances depending on the origin of the Campylobacter isolates. For example, the isolates from Georgia and Germany showed particularly high resistance to fluoroquinolones and tetracyclines. In contrast, resistance to aminoglycosides and macrolides was less common. The Campylobacter isolates from Vietnam, however, showed nearly complete resistance to fluoroquinolones and tetracyclines, and particularly the Vietnamese C. coli isolates exhibited very high resistance to aminoglycosides and macrolides. These high resistance rates in Vietnam are possibly due to the extensive use of antibiotics in livestock farming. Through the application of whole genome sequencing, phenotypic resistances could be linked to the presence of resistance determinants in the individual isolates. This showed that distinct Campylobacter populations carry different resistance markers and that Vietnamese Campylobacter isolates carried more resistance determinants.
We further investigated to what extent a data analysis based on whole genome data can be used to predict the expression of phenotypic resistance. We found that for the most part, the prediction matched the phenotypic resistance. However, discrepancies between the whole genome sequencing data and the phenotypic resistance profiles were also discovered. Problems included missing or inaccurately annotated AMR genes, detection issues due to multiple gene copies or variants, and novel mutations affecting gene functionality. Additionally, unknown resistance mechanisms were identified, such as resistance to ciprofloxacin without concurrent nalidixic acid resistance. Another resistance mechanism leading to aminoglycoside resistance was deciphered and characterized in the course of this study. By applying natural transformation and analyzing genome data, a point mutation in the 16S rRNA of Campylobacter was identified, which was causally related to aminoglycoside resistance. We were able to show that the stability of the resistance depended on how many of the three copies of the 16S rRNA present in Campylobacter had undergone this mutation. Using Nanopore long-read sequencing technology, combined with short-read data, hybrid assemblies were created for individual isolates. This allowed several isolates to be represented with their fully circular chromosome and, where applicable, additional epichromosomal units (e.g. plasmids). This provided insights into the localization and mode of spread of the identified resistance determinants. Ultimately, based on the whole genome data, it was possible to design new primers and probes and subsequently develop a pentaplex real-time PCR system. This was adequately tested and validated during this study and will be available in the future as a cost-effective alternative to whole genome sequencing to routinely monitor the most important resistance markers such as fluoroquinolone, macrolide, and tetracycline resistances. In conclusion, the great genetic diversity and observed resistances in Campylobacter, especially in regions with intensive antibiotic use, stresses the necessity for continuous monitoring of circulating resistances in a global context to control and contain the spread of resistant strains. Furthermore, this work serves as an incentive to improve public health in the future and raise awareness about reducing antibiotic consumption.
Campylobacter jejuni und Campylobacter coli gelten als die wichtigsten Erreger der Campylobacteriose beim Menschen, die weltweit große Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit hat. In Europa stellen sie mit Abstand die meisten Fälle von bakteriell verursachter Gastroenteritis dar. Besonders gefürchtet, aber dennoch von der allgemeinen Bevölkerung unterschätzt, sind die Langzeitfolgen einer Erkrankung, die in seltenen Fällen auftreten können, wie das Guillain-Barré-Syndrom, reaktive Arthritis und das Reizdarmsyndrom. Der übermäßige Einsatz von Antibiotika in der Human- und Veterinärmedizin hat zu einer zunehmenden Resistenz dieser Bakterien gegen antimikrobielle Mittel geführt, was die Behandlungsmöglichkeiten einschränkt. Entsprechend wird Campylobacter von der Centers for Disease Control and Prevention (CDC) insbesondere wegen seiner Fluorchinolon-Resistenz als resistentes Bakterium mit hoher Priorität und als ernsthafte Bedrohung der öffentlichen Gesundheit eingestuft. Diese Studie hatte zum Ziel, die Antibiotikaresistenzen von Campylobacter-Isolaten aus unterschiedlichen Regionen der Welt zu vergleichen, um für die Humanmedizin relevante und für Europa bevorstehende Resistenzdeterminanten zu identifizieren, die sich unter hohem Selektionsdruck entwickeln und eine Herausforderung für die öffentliche Gesundheit darstellen. Aufgrund der Ergebnisse dieser vergleichenden Studie sollte ein neuartiges Warninstrument entwickelt werden, welches auf molekularer Ebene für den Einsatz in Routineüberwachungsprogrammen verwendet werden kann. Die Ergebnisse unserer vergleichenden Studie zeigten Unterschiede in der Ausprägung verschiedener Resistenzen je nach Herkunftsort der Campylobacter-Isolate. So wiesen die Isolate in Georgien und Deutschland im besonderen hohe Resistenzen gegenüber Fluorchinolonen und Tetrazyklinen auf. Hingegen waren Resistenzen gegenüber Aminoglykosiden und Makroliden eher seltener zu beobachten. Die Campylobacter-Isolate aus Vietnam zeigten indes eine nahezu vollständige Resistenz gegen Fluorochinolone und Tetrazykline und besonders die vietnamesischen C. coli Isolate wiesen sehr hohe Resistenz gegenüber Aminoglykosiden und Makroliden auf. Diese hohen Resistenzraten in Vietnam sind womöglich auf den umfangreichen Einsatz von Antibiotika in der Tierhaltung zurückzuführen. Durch die Anwendung der Ganzgenomsequenzierung konnten die phänotypischen Resistenzen mit dem Vorhandensein von Resistenzdeterminanten in den einzelnen Isolaten verknüpft werden. Dies zeigte, das distinkte Campylobacter Populationen unterschiedliche Resistenzmarker tragen und das vietnamesische Campylobacter Isolate mehr Resistenzdeterminanten trugen. Wir fragten uns ferner inwieweit eine Datenanalyse basierend auf Ganzgenomdaten zur Vorhersage einer Ausprägung einer phänotypischen Resistenz herangezogen werden kann. Wir stellten fest, dass zwar für einen Großteil die Vorhersage mit der phänotypischen Resistenz übereinstimmte. Jedoch konnten auch Diskrepanzen zwischen den Daten der Ganzgenomsequenzierung und den phänotypischen Resistenzprofilen aufgedeckt werden. Zu den Problemen gehörten fehlende oder ungenau annotierte AMR-Gene, Nachweisprobleme aufgrund von Mehrfachgenkopien oder -varianten sowie neuartige Mutationen, die die Genfunktionalität beeinflussten. Außerdem wurden auch unbekannte Resistenzmechanismen identifiziert, wie die Resistenz gegen Ciprofloxacin ohne gleichzeitige Nalidixinsäure-Resistenz. Ein weiterer Resistenzmechanismus, der zu einer Aminoglykosidresistenz führt, konnte im Rahmen der Studie entschlüsselt und charakterisiert werden. Durch Anwendung der natürlichen Transformation und Analyse von Genomdaten, konnte eine Punktmutation in der 16S rRNA von Campylobacter ausfindig gemacht werden, die im kausalen Zusammenhang mit der Aminoglykosidresistenz stand. Wir konnten zeigen, dass die Stabilität der Resistenz davon abhängt, wie viele der drei Kopien der in Campylobacter vorkommenden 16S rRNA dieser Mutation unterlaufen waren. Durch Anwendung der Nanopore Long-Read Sequenzieruntechnik, konnten zusammen mit den Short-Read Daten für vereinzelte Isolate sogenannte Hybrid Assemblies erstellt werden. Somit konnten mehrere Isolate mit ihrem vollständig zirkulärem Chromosom und ggf. weiteren epichromosomalen Einheiten (Plasmide) dargestellt werden. Dies gab Aufschluss über die Lokalisierung und Art der Verbreitung der identifizierten Resistenzdeterminanten. Anhand der Ganzgenomdaten war es letztendlich möglich neue Primer- und Sonden zu designen und daraufhin ein Pentaplex-Real-Time PCR System zu entwickeln. Dieses wurde während der Zeit der Studie hinreichend getestet und validiert und steht in Zukunft als kostengünstige Alternative zur Ganzgenomsequenzierung bereit um routinemäßig die wichtigsten Resistenzmarker wie Fluorochinolon-, Makrolid- und Tetrazyklin Resistenzen zu beobachten. Schlussendlich lässt sich sagen, dass die große genetische Vielfalt und die beobachteten Resistenzen bei Campylobacter, insbesondere in Regionen mit starkem Antibiotikaeinsatz, die Notwendigkeit einer kontinuierlichen Überwachung zirkulierender Resistenzen im globalen Kontext unterstreichen, um die Ausbreitung resistenter Stämme zu kontrollieren und einzudämmen. Ferner stellt diese Arbeit einen Anreiz dar, zukünftig die öffentliche Gesundheit zu verbessern und das Bewusstsein im Sinne der Antibiotikaverbrauchsmengenreduzierung zu schärfen.
