Drug resistance constitutes a major challenge in the treatment of metastatic neuroendocrine cancer. Chemotherapeutic regimes for these tumours employ weak- base drugs including, for instance, etoposide. Especially for this medication, a mechanism of resistance was suggested that linked increased acidification of intracellular compartments to the evolution of drug resistance. Chloride channels of the ClC-family play a pivotal role in the pH homeostasis of cellular organelles, and recently the first evidence for a potential role of ClC-3 in drug resistance was given. Following this finding, our work aimed to further elucidate the role of ClC-channels and compartmental acidification in the evolution of etoposide resistance. In this context we focused on the question of whether an up-regulation of intracellular ClC-channels could be observed as a cellular response to chemotherapeutic drugs and whether it would entail increased compartmental acidity and thus contribute to the evolution of drug resistance in vitro. We addressed the problem through two different experimental approaches. In a first approach, cells of the neuroendocrine tumour cell line LCC-18 were selected by long-term exposure to the v-ATPase inhibitor concanamycin A and etoposide sensitivity was assessed as a function of altered pH homeostasis. In these experiments we could show that intracellular compartments were, indeed, more acidic due to concanamycin A selection and that the selected cells were also more resistant to etoposide. Moreover, exploration of gene expression by qPCR supported a potential role of ClC-3 and ClC-7 in the acquisition of an etoposide-resistant phenotype. Our data suggested that mRNA up-regulation of ClC-channels might entail increased vesicular acidification and contribute to a drug resistant phenotype. In a second approach, LCC-18 cells were selected for etoposide resistance, and compartmental acidity was assessed as a function of etoposide resistance. In the etoposide-resistant cell line intracellular compartments were also more acidic than in control cells, and this data pointed to a contribution of enhanced vesicular acidity to etoposide resistance. However, genetic investigation indicated that in these cells overexpression of ABC transporters let to the resistant phenotype: we could not observe any up-regulation of ClC- channels due to etoposide treatment. As interpretation of mRNA expression faces several limitations, further explorations are now necessary for a proper understanding of the role of vesicular acidity and ClC-channels in drug resistance.
Chemotherapieresistenz stellt eine wesenliche Herausforderung in der Behandlung von metastasierten, neuroendokrinen Tumoren dar. Therapiepläne dieser Tumore beinhalten schwach basische Medikamente wie zum Beispiel Etoposid. Für diese Medikamentengruppe wurde ein Resistenzmechanismus vorgeschlagen, der auf einer erhöhten Azidifizierung intrazellulärer Kompartimente beruht. Chlorid Kanäle der ClC-Familie spielen eine Schlüsselrolle in der pH-Homeostase intrazellulärer Organellen und kürzlich wurde erstmals eine mögliche Beteiligung von ClC-3 bei Chemotherapieresistenz gezeigt. Die vorliegende Arbeit hat in diesem Rahmen ein besseres Verständnis der Rolle von ClC-Kanälen und kompartmentaler Azidifizierung bei der Entstehung von Arzneimittelresistenz zum Ziel. Wir konzentrierten uns dabei auf die Fragen, ob eine Hochregulierung von intrazellulären ClC-Kanälen als zelluläre Antwort auf Chemotherapeutika beobachtet werden kann und ob eine solche Hochregulierung tatsächlich eine erhöhte vesikuläre Azidität nach sich ziehen und so zur Evolution von Chemotherapieresistenz in vitro beitragen kann. Die Fragestellungen wurden mittels zwei komplementärer Ansätze untersucht. In einem ersten Versuchsansatz wurden Zellen der neuroendokrinen Tumorzelllinie LCC-18 durch langfristige Exposition zu dem v-ATPase Inhibitor Concanamycin A selektiert und dann auf ihre Etoposidresistenz in Abhängigkeit von der veränderten intravesikulären pH-Homeostase untersucht. Wir konnten zeigen, dass intrazelluläre Kompartimente in der Concanamycin A-resistenten Zellinie in der Tat azidischer als in Kontrollzellen waren und dass die Zellen ebenfalls resistenter gegen Etoposid waren. Darüberhinaus deutete die Untersuchung der Genexpression mittels quantitativer Polymerasen Kettenreaktion auf eine mögliche Rolle von ClC-3 und ClC-7 bei der Entstehung des Etoposid-resistenten Phänotyps hin. Diese Daten legten nahe, dass mRNA- Hochregulierung von ClC-Kanälen eine erhöhte vesikuläre Azidifizierung nach sich ziehen und so zu einem chemotherapieresistenten Phänotyp beitragen kann. In einem zweiten Versuchsansatz wurden LCC-18 Zellen unter langzeitiger Gabe von Etoposid selektiert und die kompartimentale Azidizität in Abhängigkeit von dem Etoposid-resistenten Phänotyp untersucht. In der Etoposid-resistenten Zelllinie fanden sich azidischere intrazelluläre Kompartimente als in Kontrollzellen. Anders als in den Concanamycin A-selektieren Zellen legte die genetische Untersuchung mittels Polymerasen Kettenreaktion jedoch nahe, dass die Etoposid-selektierten Zellen mit einer Überexpression von ABC-Transportern und nicht mit einer Hochregulierung von Kontrollmechanismen des vesikulären pH-Wertes auf die Etoposidexposition reagierten. Wir konnnten dementsprechend keine Hochregulierung von ClC-Kanälen in Folge von einer Etoposidbehandlung beobachten. Da die Interpretation der mRNA-Expression jedoch verschiedenen Einschränkungen unterliegt, sind nun weitere Untersuchungen für ein angemessenes Verständnis der Rolle von vesikulärer Azidifizierung und ClC- Kanälen bei Chemotherapieresistenz notwendig.
