Directional proton transport across the lipid bilayer of a biological membrane is a process of fundamental importance in nature. Due to the protons’ small size, the study of proton transfer in biological macromolecules such as proteins, is a challenging task. One of the few techniques, that allows one to observe protonation reactions is infrared (IR) difference spectroscopy. Its chemical sensitivity sheds insight into the changes in protonation state of single moieties within proteins but is at the same time sensitive to all other molecular alterations accompanying proton transfer. IR difference spectroscopy is therefore a powerful tool to study the functional mechanism of proton-translocating proteins. A very intriguing question is how proteins that act as membrane-bound proton pumps achieve vectorial proton transport. The first part of this thesis aims to address this question by the spectroscopic investigation of a novel microbial rhodopsin acting as an inward proton pump. I characterized the sequence of protonation reactions with a focus on the cytoplasmic half channel of the protein. Here, deprotonation of an aspartic acid located on the cytoplasmic side is correlated to the deprotonation of the distantly located retinal Schiff base. The sequence of these protonation events has important implications on the functional mechanism of inward proton transport, which is compared to the mechanism of a prototypical outward proton pump. The structural changes associated with inward proton transfer are not only localized within the protein itself but are also transmitted to the surrounding lipid bilayer. Photoactivation of this microbial rhodopsin is sensed by the surrounding lipid molecules by two different processes occurring on a fast (< 100 ns) and a slow time scale (> μs). While time-resolved IR spectroscopy is an established tool to monitor light-induced absorption changes of reversible processes, it has found only limited application in the study of irreversible and light-insensitive reactions. In the second part of this thesis, I showcase two novel IR absorption techniques based on quantum cascade lasers (QCL) to study protein reactions. Both techniques were used to monitor protein conformational changes as well as protonation dynamics by single-shot experiments, i.e. without the need to average multiple acquisitions. After a thorough comparison of both techniques, I applied them to the study of the irreversible activation process of the G-protein-coupled receptor rhodopsin. This approach demonstrates that QCL-based IR spectroscopy is a powerful tool for the spectroscopic study of irreversible and, in the future, also light-insensitive (protein) reactions.
Protonentransfer über die Lipiddoppelschicht einer biologischen Membran ist ein Prozess von höchster Relevanz in der Natur. Da Protonen sehr klein sind, stellt die experimentelle Untersuchung von Protonentransferreaktionen eine große Herausforderung dar. Eine der wenigen Methoden, die es ermöglicht, Protonentransfer nachzuweisen, ist Infrarot (IR) Differenzspektroskopie. Die chemische Sensitivität der IR-Spektroskopie ermöglicht es, Protonierungszustände von funktionellen Gruppen innerhalb eines Proteins zu bestimmen und liefert gleichzeitig Erkenntnisse über anderweitige strukturelle Änderungen, die ggf. simultan ablaufen. Daher ist IR-Spektroskopie eine geeignete Methode, um Funktionsmechanismen jener Proteine zu untersuchen, die in biologischem Protonentransfer involviert sind. Für das Verständnis von Membranproteinen, die als Protonenpumpen fungieren, ist es wichtig zu verstehen, was die Richtung des Transports bestimmt. Im ersten Teil dieser Arbeit soll diese Frage adressiert werden, indem ein mikrobielles Rhodopsin untersucht wird, das Protonen in das Innere der Zelle pumpt. Mittels zeitaufgelöster Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass die Deprotonierung einer Asparaginsäure zeitlich mit der Deprotonierung der Schiff‘schen Base am Retinalchromophor korreliert ist. Die Abfolge dieser Protonentransferreaktionen hat relevante Implikationen für den Funktionsmechanismus dieser inwärts gerichteten Protonenpumpe, welcher mit den bereits bekannten Mechanismen für auswärts gerichtete Protonenpumpen verglichen werden kann. Die lichtgetriebenen Strukturänderungen, sind nicht nur im Protein selbst lokalisiert, sondern beeinflussen auch die Struktur der umgebenden Lipidmoleküle in der Membran. Die Aktivierung dieses mikrobiellen Rhodopsins führt zu einer strukturellen Änderung in der umgebenden Membran in einem schnellen (< 100 ns) und einem langsamen Prozess (> μs). Konventionelle zeitaufgelöste IR-Spektroskopie ist eine gängige Methode, um reversible, lichtgetriebene Prozesse zu untersuchen, aber kann nur selten verwendet werden, um irreversible oder gar licht-unabhängige Prozesse zu untersuchen. Im zweiten Teil dieser Arbeit vergleiche ich zwei neuartige IR-spektroskopische Methoden basierend auf Quantenkaskadenlasern (QCL) im Hinblick auf ihre Anwendung zur Untersuchung von Protonierungsdynamiken und Konformationsänderungen in Proteinen. Beide Methoden ermöglichen die Datenerfassung mit hohem Signal-zu-Rausch Verhältnis bei jeder einzelnen Acquisition, was das Mitteln mehrerer Experimente erspart. Aufgrund dieser Tatsache konnte ich die irreversible Aktivierung des G-protein-gekoppelten Rezeptors Rhodopsin zeitaufgelöst messen. Dies zeigt, dass IR-Spektrometer basierend auf QCLs eine geeignete Möglichkeit darstellen, irreversible und in der Zukunft auch lichtunabhängige (Protein)-Reaktionen IRspektroskopisch zu untersuchen.
