Alternative splicing of pre-mRNAs can regulate the expression and function of proteins. As such it is a major tool of eukaryotes to adapt their proteome – and thus the whole organism – to external and internal changes of circumstances. In mammals body temperature cycles result in oscillating alternative splicing driven by rhythmic phosphorylation of SR-proteins. Recently, it has been shown that this is facilitated by temperature dependent activity of Cdc2-like kinases (CLKs). Temperature sensitivity is conserved across evolution and the active temperature range of the kinases is adapted to the body temperature or growth temperature of the corresponding organism. While it has been shown that the temperature dependence of CLK activity is mediated by conformational changes in the activation segment, the mechanisms by which the active temperature range of the kinases is adapted to the organisms body temperature remained elusive. Here we show multiple structural features fine-tuning the active temperature range of CLK homologues. We characterized a CLK homologue, CmLIK, and its substrate phosphorylation from the ancient thermophilic red alga C. merolae and could show that kinase activity at high temperatures is mediated by activation segment stabilization via a salt bridge in the P+1 loop. In contrast to other CLK homologues auto phosphorylation of CmLIK shows markedly different patterns than substrate phosphorylation. Furthermore, we identified an H-bond network from a residue in the P+1 loop of a CLK homologue from A. thaliana, AtAFC3, that stabilizes the activation segment and also mediates kinase activity at higher temperatures. We could show that AFCs play a role in heat responsive hypocotyl elongation in A. thaliana upstream of PIF4, the major regulator of thermomorphogenesis. Our results demonstrate stabilization of the P+1 loop of the activation segment as a common mechanism mediating CLK homologue activity at high temperatures. With the characterization of CmLIK we found a model system to study an ancient CLK homologue with activity at high temperatures. Our findings lay the foundation for exploration of genetic engineering of crop plant AFCs to facilitate kinase activity at higher temperatures and adapting their thermomorphogenesis accordingly. This could lead to a partial solution of the problems crop plant growth faces due to global warming.
Durch alternatives Spleißen von Prä-mRNAs kann die Expression und Funktion von Proteinen reguliert werden. Deshalb ist es ein wichtiges Werkzeug für Eukaryoten, um ihr Proteom – und damit den gesamten Organismus – an äußere und innere Veränderungen anzupassen. Bei Säugetieren führt der zyklische Verlauf der Körpertemperatur zu oszillierendem alternativem Spleißen, das durch die rhythmische Phosphorylierung von SR-Proteinen angetrieben wird. Kürzlich wurde gezeigt, dass dies durch die temperaturabhängige Aktivität von Cdc2-ähnlichen Kinasen (CLKs) kontrolliert wird. Die Temperaturempfindlichkeit der Kinasen ist evolutionär konserviert und der aktive Temperaturbereich ist an die Körpertemperatur bzw. Wachstumstemperatur des entsprechenden Organismus angepasst. Es konnte gezeigt werden, dass die Temperaturabhängigkeit der CLK-Aktivität durch Konformationsänderungen im Aktivierungssegment vermittelt wird, aber die Mechanismen, durch die der aktive Temperaturbereich der Kinasen an die Körpertemperatur des Organismus angepasst wird, blieben unklar. Hier zeigen wir mehrere Strukturmerkmale, die den aktiven Temperaturbereich von CLK-Homologen anpassen. Wir haben ein CLK-Homolog, CmLIK, aus der thermophilen Rotalge C. merolae und dessen Substratphosphorylierung charakterisiert. Dabei konnten wir zeigen, dass die Kinaseaktivität bei hohen Temperaturen durch die Stabilisierung des Aktivierungssegments über eine Salzbrücke im P+1-loop vermittelt wird. Im Gegensatz zu anderen CLK-Homologen folgt die Autophosphorylierung von CmLIK nicht demselben Muster wie die Substratphosphorylierung. Darüber hinaus haben wir ein Wasserstoffbrückennetzwerk um einen Rest im P+1-loop eines CLK-Homologs aus A. thaliana, AtAFC3, identifiziert. Dieses stabilisiert das Aktivierungssegment und vermittelt ebenfalls die Kinaseaktivität bei höheren Temperaturen. Wir konnten zeigen, dass AFCs über PIF4, dem Hauptregulator der Thermomorphogenese, eine Rolle bei der wärmeresponsiven Hypokotyl Verlängerung in A. thaliana spielen. Unsere Ergebnisse zeigen die Stabilisierung des P+1-loops des Aktivierungssegments als einen allgemeinen Mechanismus, der die Aktivität von CLK-Homologen bei hohen Temperaturen vermittelt. Mit der Charakterisierung von CmLIK haben wir ein Modellsystem gefunden, um ein CLK-Homolog mit Aktivität bei hohen Temperaturen zu untersuchen. Unsere Ergebnisse legen den Grundstein für die Erforschung der genetischen Modifizierung von AFCs in Nutzpflanzen, um die Kinaseaktivität bei höheren Temperaturen zu ermöglichen und ihre Thermomorphogenese entsprechend anzupassen. Dies könnte zu einer teilweisen Lösung der Probleme beim Anbau von Nutzpflanzen aufgrund der globalen Erwärmung führen.
