Die im Kindesalter am häufigsten vorkommende neoplastische Erkrankung des blutbildenden Systems ist die Akute Lymphoblastische Leukämie (ALL). Innerhalb von standardisierten Therapieprotokollen wird unter Verwendung von Immunglobulin / T-Zellrezeptor Genumlagerungen die minimale Resterkrankung (MRD) quantifiziert. Die MRD dient als stärkster unabhängiger prognostischer Parameter nicht nur zur Stratifizierung der Patienten in Behandlungsgruppen unterschiedlicher Chemotherapieintensitäten, sondern auch der kontinuierlichen Therapieanpassung. Die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) ist die derzeit standardisierte und etablierte PCR-basierte Technologie zur MRD-Quantifizierung. Als relative Messmethode ergeben sich jedoch technologische Limitationen. Die neue PCR-Technologie, Droplet Digital PCR (ddPCR), bietet mehrere methodische Fortschritte, die eine präzisere Quantifizierung des MRD-Wertes ermöglichen könnten. Sie zeichnet sich dadurch aus, dass das Reaktionsvolumen mit der zu untersuchenden DNA-Sequenz in Partitionen aufgeteilt wird und so einzelne, voneinander unabhängige PCR-Reaktionen realisiert werden. In der vorliegenden Studie wurden die beiden Messmethoden in Bezug auf die MRD-Quantifizierung im Rahmen einer Blindstudie mit Proben von pädiatrischen Patienten mit einem ALL-Rezidiv miteinander verglichen. Es erfolgte ein prospektiver Abgleich der Messergebisse mit der Multi-Color-Durchflusszytometrie (Flow) als eine dritte MRD-Quantifizierungsmethode. Zudem wurde ein retrospektiver Studienansatz gewählt, um die qualitative und quantitative Messgenauigkeit der ddPCR im Vergleich zur qPCR zu überprüfen. Hierbei wurden ausgewählte Proben einer adulten Kohorte mit der ddPCR reevaluiert, die ein positives jedoch niedrig-kritisches MRD-Ergebnis aufwiesen. Die veröffentlichten Leitlinien (qPCR) und die neuesten Auswertungs- und Interpretationskriterien (ddPCR, Flow) wurden für die Datenanalyse angewandt. Diejenigen der ddPCR wurden im Rahmen dieser Studie überarbeitet und spezifiziert. Die erhobenen Ergebnisse belegten, dass die ddPCR eine überlegene Messgenauigkeit sowie eine akkurate Reproduzierbarkeit gegenüber der qPCR aufweist. Es konnte gezeigt werden, dass die ddPCR in Bezug auf die Sensitivität und dem Limit der Quantifizierung (QL) in großem Maße die der qPCR übersteigt und dadurch eine präzisere Ermittlung des MRD-Wertes gerade bei Proben mit geringen DNA-Mengen ermöglicht. So wurde die Anzahl von BQL-MRD-Ergebnissen gegenüber der qPCR deutlich reduziert. Zudem zeigte sich im Abgleich der Ergebnisse der ddPCR und qPCR mit der Flow-Methode, dass die Flow-MRD-Ergebnisse eher denen der ddPCR als der qPCR entsprechen. Basierend auf den Ergebnissen dieser Studie erscheint die ddPCR als diejenige Messmethode, die eine sensitivere und akkuratere MRD-Quantifizierung ermöglicht, was folglich die klinische Entscheidungsfindungen in Zukunft erleichtern könnte. Somit erweist sich die ddPCR als eine mögliche additive Diagnostikmethode oder sogar als eine potentielle Alternative zur qPCR für die MRD-Quantifizierung bei der ALL. In repräsentativen klinischen Studien muss zukünftig die Erleichterung der klinischen Entscheidungsfindung durch die Anwendung der ddPCR hinsichtlich der MRD-Quantifizierung weitergehend untersucht werden.
The most common neoplastic disease of the blood-forming system in childhood is Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL). Within standardized therapy protocols, the Minimal Residual Disease (MRD) is quantified using immunoglobulin / T-cell receptor gene rearrangements. As the strongest independent prognostic parameter, it serves to stratify patients into treatment groups of different intensities of chemotherapy and also for continuous therapy adjustment. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) is the currently standardized PCR-based technology for MRD quantification. As a relative measurement method, however, there are technological limitations. The new PCR-technology, Droplet Digital PCR (ddPCR), offers several methodological advances that could enable more precise MRD quantification. This method divides the reaction volume with the DNA sequence into partitions so that individual, independent PCR reactions can be realized. In the present study, the two methods were compared with regard to MRD quantification within the framework of a blind study in which samples from pediatric patients with an ALL-relapse were measured. A prospective comparison of the results with multi-color flowcytometry (Flow) as a third MRD quantification method was performed. In addition, a retrospective study approach was chosen to assess the qualitative and quantitative accuracy of ddPCR compared to qPCR. Selected samples from an adult cohort were reevaluated with ddPCR, which showed a positive but low-critical MRD. The published guidelines (qPCR) and the latest evaluation and interpretation criteria (ddPCR, Flow) were applied for the data analysis, those of ddPCR were revised and specified in the context of this study. The results demonstrated that ddPCR has superior measurement accuracy and accurate reproducibility. It could be proven that ddPCR exceeds qPCR in terms of sensitivity and limit of quantification (QL) and thus enables a more precise determination of the MRD. Consequently, the number of low-critical MRD that were below the QL was significantly reduced compared to qPCR. In addition, the comparison of the results of ddPCR and qPCR with Flow showed that the Flow-MRD-results corresponded more to those of ddPCR than qPCR. Based on the results of this study, ddPCR appears to be the measurement method that provides more sensitive and accurate MRD quantification, which could subsequently facilitate clinical decision-making. Thus, ddPCR proves to be a possible additive diagnostic method or even a potential alternative to qPCR for MRD quantification in ALL. In representative clinical studies, the facilitation of clinical decision-making by the application of ddPCR with regard to MRD quantification must be further investigated in the future.
