Das Opitz-Syndrom (OS) ist eine heterogene Erbkrankheit, die durch Organfehlbildungen der vorderen Mittellinie charakterisiert ist. OS kann autosomal dominant oder X-chromosomal rezessiv vererbt werden. Der Genlocus der ersten Form liegt auf Chromosom 22, das krankheitsverursachende Gen wurde bis jetzt jedoch nicht identifiziert. Die X-chromosomale Form des OS wird durch Mutationen in dem ubiquitär exprimierten MID1-Gen verursacht. Bisher konnten für etwa 75% der X-chromosomalen Fälle Mutationen in den kodierenden Bereichen dieses Gens identifiziert werden, wobei die meisten dieser Mutationen (68%) im C-terminalen Bereich lokalisiert sind. Die restlichen Mutationen sind über das gesamte Protein mit Ausnahme des RING-Fingers verteilt. Das MID1-Gen kodiert für ein RING-Finger-Protein, das neben dem RING-Finger zwei Bboxen, eine coiled coil Domäne, eine Fibronektin Typ III Domäne und eine C-terminale B30.2-Domäne enthält. Es besitzt, wie andere RING- Finger-Proteine auch, Ubiquitin-Ligase Aktivität. Über die 1. BBox bindet es an eine regulatorische Untereinheit der Mikrotubulus-assoziierten Phosphatase 2A (PP2Ac), das α4-Protein, was zur Übertragung von Ubiquitin auf die PP2Ac führt. Mikrotubulus-assoziierte PP2Ac wird somit für den Abbau im Proteasom markiert. Mutiertes MID1-Protein in OS-Patienten hat die Fähigkeit, an Mikrotubuli zu binden, verloren und kann daher nicht mehr in Kontakt zu Mikrotubulus-assoziierter PP2A treten. Die Ubiquitinierung von PP2Ac wird verhindert und PP2Ac akkumuliert in der Zelle. Auf 2D-Gelen konnte im Rahmen dieser Arbeit eine allgemeine Hypophosphorylierung Mikrotubulus-assoziierter Zielproteine von PP2Ac in embryonalen Fibroblasten von OS-Patienten gezeigt werden. Weitere Untersuchungen könnten diese Zielproteine identifizieren und die Bedeutung ihrer Hypophosphorylierung für die Entstehung von OS klären. Die Funktion der 2. Bbox des MID1-Proteins war am Anfang dieser Arbeit nicht bekannt. In Immunfluoreszenz-Experimenten konnte im Rahmen dieser Arbeit ein entscheidender Einfluß der 2. BBox auf die Bindungsaffinität der 1. BBox an das α4-Protein nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde durch die Entwicklung einer auf dem Erkennen von Mutationen in der mRNS basierenden Diagnostik für OS-Patienten die Voraussetzung geschaffen, die genetischen Defekte in weiteren Fällen mit X-chromosomalen OS, für die bisher keine MID1-Mutation gefunden wurde, aufzudecken. So konnte in einer Familie mit X-chromosomalem OS eine Duplikation von Exon 1 des MID1-Gens identifiziert werden. Durch NMD (durch vorzeitige Stopkodons vermittelter mRNA-Abbau) kommt es zum Abbau der MID1-Transkripte in dieser Familie. Ebenfalls unklar war, wie Mutationen in dem ubiquitär exprimierten MID1-Gen den spezifischen, auf Organe der vorderen Mittellinie beschränkten, Phänotypen des OS hervorrufen. Zur Aufklärung der beteiligten Regulationsmechanismen wurden die genomischen Sequenzen des humanen und des Maus-mid1-Gens untersucht und miteinander und mit der genomischen Sequenz des Fugu-MID1-Gens verglichen. Sowohl im Menschen als auch in der Maus und in Fugu konnten zahlreiche alternativ gespleißte Exons identifiziert werden, die einer entwicklungs- und gewebsspezifischen Expression unterliegen. Zwischen allen drei Organismen, Mensch, Maus und Fugu konnte eine funktionelle Konservierung der alternativ gespleißten Transkripte festgestellt werden. Zum einen konnte die Existenz protein-trunkierender Transkripte bzw. trunkierter Proteine in den drei Organismen gezeigt werden, die als dominant-negative Regulatoren der MID1-Protein-Funktion fungieren. Zweitens wurden in den drei Spezies Mensch, Maus und Fugu alternativ gespleißte Transkripte identifiziert, die durch das Einführen vorzeitiger Stopkodons in die jeweiligen Sequenzen über NMD abgebaut werden und darüber regulatorisch in die MID1-Expression eingreifen. Ausser alternativ gespleißten Exons konnte im Intron 1 des MID1-Gens eine zwischen Mensch und Maus homologe Region, Reg 1d, identifiziert werden, die 1.126 bp umfasst. In RT-PCR- Experimenten konnte gezeigt werden, dass Reg 1d zwar exprimiert wird, jedoch weder Verbindung zu den MID1-Exons aufweist noch einen eigenen offenen Leserahmen besitzt. Interessanterweise konnten Northernblot-Analysen zeigen, dass Reg 1d sowohl vom Sense- als auch vom Antisense-Strang transkribiert wird. Möglicherweise ist Reg1d eine regulatorische RNA. Weitere Untersuchungen könnten die regulatorische Verknüpfung von Reg1d und MID1 zeigen und so zur weiteren Aufklärung der Entstehung des Phänotypen in OS-Patienten beitragen.
Opitz BBB/G syndrome (OS) is a heterogenous hereditary disorder that is characterized by defects in organs derived from the ventral midline. The inheritance of OS can be autosomal dominant or X-chromosomal recessive. The gene for the autosomal form of OS has been assigned to chromosome 22, but it has not been identified yet. The X-chromosomal form of OS is caused by mutations in the ubiquitously expressed MID1-gene. Mutations in the coding regions of the MID1-gene account for approximately 75% of X-chromosomal OS cases. Most mutations (68%) involve the C-terminal part of the protein, and the remaining mutations are spread all over the protein except for the RING finger domain. Apart from this domain, the gene product of MID1 consists of two Bboxes, a coiled coil domain, a Fibronectin type III domain and a C-terminal B30.2 domain. Like other RING finger proteins, the MID1 protein shows ubiquitin ligase activity. With its Bbox 1, it binds to a4, a regulatory subunit of microtubule-associated Phosphatase 2A (PP2Ac) thereby causing ubiquitination of PP2Ac and its subsequent degradation via the proteasome. Mutated MID1 protein in OS patients has lost its ability to bind to microtubules. As a consequence, it cannot interact with microtubule-associated PP2Ac, ubiquitination of PP2Ac is inhibited and PP2Ac accumulates in the cell. We could now show overall hypophosphorylation of microtubule-associated target proteins of PP2Ac in embryonic fibroblasts of an OS patient on 2D gels. Further investigations will identify these proteins and clarify the biological relevance of their hypophosphorylation for the natural history of OS syndrome. The function of the Bbox2 of the MID1 protein and other RBCC-proteins is unknown. In immunofluorescence experiments that were part of this thesis it was found that a point mutation in the Bbox2 inhibits the association of the a4-protein to the microtubules. This indicates that the Bbox2 has a crucial effect on the binding affinity of Bbox1 to the a4-protein. Beyond this, we have shown that some of the patients with OS have mutations in the MID1 gene which cannot be detected by DNA sequencing. Thus, a duplication of exon 1 of the MID1 gene could be found in one OS-family. A premature termination codon at the beginning of the second copy of exon 1 destabilizes the mRNA according to nonsense-mediated mRNA decay. Moreover, I have addressed the question how mutations in the MID1 gene can lead to the highly tissue-specific OS phenotype despite ubiquitous expression of the MID1 gene. To shed more light on mechanisms regulating MID1 protein function, genomic sequences of the human, the murine and the Fugu MID1 gene were characterized and compared with each other. Numerous alternatively spliced exons which are subject to tissue- and developmental specific expression could be identified. A functional conservation of alternatively spliced transcripts could be shown between the three organisms, human, mouse and fugu. On the one hand protein-truncating transcripts or rather truncated proteins that regulate the protein function of MID1 in a dominant negative manner could be found in all three organisms. On the other hand, alternatively spliced transcripts that introduce premature termination codons into the respective sequences and are therefore subject to NMD could be found in all three organisms. Thereby, these transcripts act as regulators of MID1 expression. Moreover, a region, Reg1d, with high homology between man and mouse mapping to intron 1 of the MID1 gene and spanning a region of 1.126 bp could be identified. Though RT-PCR experiments could show its expression, Reg1d doesn?t exhibit a connection to any of the MID1 exons. An open reading frame of significant length could not be detected in Reg1d transcripts. Interestingly, northernblot analysis could demonstrate transcription of Reg1d from both strands, sense and antisense, suggesting Reg1d to function as a regulatory RNA-molecule. Future experiments may show that Reg1d and MID1 are functionally connected and may further elucidate how the phenotype in OS patients develops.
