dc.contributor.author
Montacir, Houda
dc.date.accessioned
2018-06-07T17:56:56Z
dc.date.available
2014-07-16T11:32:59.761Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/4458
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-8658
dc.description.abstract
Die Glykokalyx ist eine dichte Schicht an der Zelloberfläche, die sich aus
komplexen Kohlenhydratstrukturen zusammensetzt. Qualitative und quantitative
Veränderungen des Glykosylierungsmusters der Zelloberfläche können genutzt
werden, um bestimmte Stammzellpopulationen zu identifizieren, um die
Differenzierungs einer Stammzelle (SZ) zu verfolgen sowie den Verlust des SZ-
Status festzustellen, was von großer Bedeutung auf dem Gebiet der
regenerativen Medizin sowie des Tissue Engineerings ist. In der vorliegenden
Arbeit wurde eine einfache, schnelle, reproduzierbare und sensitive Methode
zur Charakterisierung des N-Glykosylierungsprofils der Zelloberfläche
etabliert und optimiert. Die häufig genutze Methode zur Analyse der
N-Glykosylierung von Zellen besteht aus der Isolierung von
Membranglykoproteinen, der einer enzymatischen N-Glykanfreisetzung folgt.
Jedoch ist bei Anwendung dieser Methode der Anteil der N-Glykane vom High-
Mannose-Typ relativ hoch, wobei diese vorwiegend aus intrazellulären Proteinen
des endoplasmatischen Retikulums (ER) stammen können. Für die neu etablierte
Methode, die direkt Glykopeptide der Zelloberfläche freisetzt, konnte mittels
MALDI-TOF-MS eine Erniedrigung des Anteils an N-Glykanen vom High-Mannose-Typ
von 90 % auf 10 % bestätigt werden. Zudem konnte die Sensitivität der
Detektion sowie Quantifizierung der N-Glykane vom Komplex-Typ stark verbessert
werden. Die Selektivität der neuen Methode wurde am Beispiel der Zelllinien
HEK 293, CHO-K1, AGE1.HN und Hep G2 getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass die
N-Glykosylierung der Zelloberfläche der untersuchten Zelllinien strukturell
die Hauptmerkmale der Glykoproteine aufwiesen, welche rekombinant in ihnen
produziert werden. Unter Verwendung der neu etablierten Methode, wurde das
N-Glykosylierungsmuster der Zelloberfläche von aus Knochenmark isolierten
humanen mesenchymalen Stammzellen (MSZn) und den aus ihnen adipogen,
chondrogen sowie osteogen differenzierten Zellen mittels MALDI-TOF-MS und CE-
LIF untersucht. Darüberhinaus wurden zur Bestätigung der gefundenen Strukturen
Exoglykosidaseverdaus des Gesamt-N-Glykanpools sowie Fragmentierungen der
N-Glykansignale über MALDI-TOF/TOF-MS Analysen durchgeführt. Analog wurde
verfahren, um das N-Glykosylierungsmuster der Zelloberfläche von humanen
embryonalen Stammzellen (ESZn) vor und nach ihrer Differenzierung in
Hepatozyten-ähnliche Zellen zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass das
N-Glykom von adipogen differenzierten MSZn im Vergleich zu undifferenzierten
MSZn eine deutlich geringere Fucosylierung sowie Antennarität aufweist.
Aufgrund eines signifikant erhöhten Anteils werden die N-Glykane H6N5F1 und
H7N6F1 als potentielle Glykan-basierte Stammzellmarker für undifferenzierte
MSZn sowie H3N4F1 und H5N4F3 für adipogen differenzierte MSZn vorgeschlagen.
Das N-Glykosylierungsprofil der Zelloberfläche von chondrogen differenzierten
MSZn vor und nach Isolierung aus ihrer extrazellularen Matrix (EZM) wurde
untersucht und mit dem Profil undifferenzierter MSZn verglichen. Die
Ergebnisse zeigten einen erhöhten Anteil von High-Mannose-Typ Strukturen sowie
einen geringeren Anteil von Komplex-Typ N-Glykanen in chondrogen
differenzierten MSZn mit EZM. Im Falle des Nichtvorhandenseins der EZM wird
die Differenzierung von einem erhöhten Anteil biantennärer N-Glykane
begleitet. Im Vergleich zu den undifferenzierten MSZn wies das N-Glykanprofil
chondrogen differenzierter MSZn eine geringere Antennarität auf. Es wurden
N-Glykane mit Fucosen (Fuc) detektiert, die am N-Acetylglucosamin des
reduzierenden Endes der Kernstruktur (core-Fucosylierung) oder an den Antennen
gebunden vorlagen (LewisX Epitope). Die triantennären N-Glykane H6N5F1 und
S1H6N5F1 sowie tetraantennären Strukturen H7N6F1, S1H7N6F1 und S2H7N6F1 werden
als potentielle Glykan-basierte Biomarker für undifferenzierte MSZn
vorgeschlagen. Zudem werden die biantennären N-Glykane S1H5N4F2 und S2H5N4F1
als potentielle Glykan-basierte Biomarker für chondrogen differenzierte MSZn
vorgeschlagen, die aus ihrer EZM isoliert waren. Die biantennären Strukturen
H3N4F1, H4N4F1 und H4N4F2 werden als Glykan-basierte Biomarker für chondrogen
differenzierte MSZn mit EZM vorgeschlagen. Die osteogene Differenzierung von
MSZn wurde begleitet von einem erhöhten Anteil biantennärer N-Glykane. Zudem
war die Antennarität der N-Glykosylierung der Zelloberfläche osteogen
differenzierter MSZn geringer. Der Anteil fucosylierter Strukturen war nach
der Differenzierung erhöht und bestand hauptsächlich aus core-fucosylierten
N-Glykanen. Als potentielle Glykan-basierte Biomarker für osteogen
differenzierte MSZn werden die biantennären Strukturen H4N4F2, H5N4, H5N4F1,
S1H5N4 und S1H5N4F1 vorgeschlagen. Das N-Glykosylierungsprofil
undifferenzierter ESZn und den aus ihnen differenzierten Hepatozyten-ähnlichen
Zellen war signifikant unterschiedlich. ESZn enthielten einen höheren Anteil
an N-Glykanen vom High-Mannose-Typ wohingegen N-Glykane vom Komplex-Typ, wie
zum Beispiel bi- und triantennäre Strukturen, dominant vertreten waren in
Hepatozyten-ähnlichen Zellen. Zudem waren in den Hepatozyten-ähnlichen Zellen
vollgalactosylierte Strukturen viel häufiger vertreten als in
undifferenzierten ESZn. Das GalNAc Epitop konnte als strukturell
charakteristisch in Hepatozyten-ähnliche Zellen nachgewiesen werden. Basierend
auf den Ergebnissen wurden die High-Mannose-Typ N-Glykane H6-9N2 und die
Komplex-Typ N-Glykane H4N4F1 und H3N5F1 als potentielle Glykan-basierte
Biomarker für humane ESZn vorgeschlagen. Die biantennären N-Glykane H5N4,
H5N4F1, H5N4F2, S1H5N4, S1H5N4F1 und S2H5N4F2 sowie die triantennären
Strukturen H6N5F1 und S1H6N5F1 wurden als potentielle Biomarker für
Hepatozyten-ähnliche Zellen vorgeschlagen.
de
dc.description.abstract
The glycocalyx is a dense cell surface layer composed of complex carbohydrate
structures. Qualitative and quantitative changes of the cell surface
N-glycosylation pattern can be used to identify stem cell (SC) populations, to
monitor SC differentiation as well as the loss of the SC status, which is of
high relevance in the field of regenerative medicine and tissue engineering.
In this study, a simple, rapid, reproducible and sensitive method to profile
cell surface N-glycosylation was established and optimised. The common
procedure involves the isolation of membrane (glyco)proteins, which is then
followed by an enzymatic N-glycan release. However, this method yields a major
proportion of high-mannose N-glycans that may stem from intracellular proteins
derived from the endoplasmic reticulum (ER). With the new method, that
directly releases cell surface (glyco)peptides, a decrease of the amount of
high-mannose N-glycans from 90 % to 10 % was verified using MALDI-TOF-MS. At
the same time, the detection sensitivity and quantification of complex-type
N-glycans was drastically improved. The selectivity of the new method was
tested by applying it to the cell lines HEK 293, CHO-K1, AGE1.HN and Hep G2.
The data revealed that the cell surface N-glycosylation of these cells
displays the main glycan features that are found on recombinant glycoproteins
produced from these cell lines. Using the new method, the cell surface
N-glycosylation pattern of human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) and
their adipogenically, chondrogenically as well as osteogenically
differentiated progeny was investigated and verified using MALDI-TOF-MS and
CE-LIF in combination with exoglycosidase digestions and MALDI-TOF/TOF
fragmentation analysis. The same was done to profile the cell surface
N-glycosylation pattern of human embryonic stem cells (ESCs) before and after
their differentiation into hepatocyte-like cells. The results showed that the
N-glycome of adipogenically differentiated MSCs was clearly less fucosylated
and branched than the one of undifferentiated MSCs. Due to their significantly
increased amount, N-glycans like H6N5F1 and H7N6F1 are proposed as candidate
MSC markers for undifferentiated MSCs and N-glycans like H3N4F1 and H5N4F3 as
potential markers for adipogenically differentiated MSCs. The N-glycosylation
profile of chondrogenically differentiated MSCs was investigated before and
after isolation from their extracellular matrix (ECM) and compared to the
profile of undifferentiated MSCs. The data revealed that they contained more
high-mannose and less complex N-glycans when their ECM was present.
Differentiation was accompanied by an increased amount of biantennary
N-glycans when the ECM was absent. Cell surface N-glycosylation of
chondrogenically differentiated MSCs was generally less branched than the one
of undifferentiated MSCs. N-glycans were found to contain core-linked fucose
(Fuc) as well as LewisX epitopes. The triantennary N-glycans H6N5F1 and
S1H6N5F1 as well as tetraantennary structures H7N6F1, S1H7N6F1 and S2H7N6F1
were proposed as glycan-based biomarkers for undifferentiated MSCs. The
biantennary structures S1H5N4F2 and S2H5N4F1 are proposed as glycan-based
biomarkers for chondrogenically differentiated cells without ECM and the
biantennary N-glycans H3N4F1, H4N4F1 and H4N4F2 for chondrogenically
differentiated cells with ECM. Osteogenic differentiation of MSCs was
accompanied by an increased amount of biantennary structures. In addition,
cell surface N-glycosylation was less branched in osteogenically
differentiated MSCs. Furthermore, the amount of fucosylated structures
increased with differentiation and contained mainly core-linked Fuc residues.
The biantennary structures H4N4F2, H5N4, H5N4F1, S1H5N4 and S1H5N4F1 were
proposed as glycan-based biomarkers for osteogenically differentiated cells.
The N-glycosylation profiles of undifferentiated ESCs and hepatocyte-like
cells were qualitatively and quantitatively significantly different. ESCs
contained a high amount of high-mannose N-glycans. In contrast, complex-type
N-glycans such as biantennary and triantennary N-glycans were dominant in
hepatocyte-like cells and fully-galactosylated structures were much more
abundant than in undifferentiated ESCs. In addition, the GalNAc epitope was
detected in hepatocyte-like cells. High-mannose-type N-glycans of the form
H6-9N2 and the complex-type N-glycans H4N4F1 as well as H3N5F1 were proposed
as glycan-based biomarkers for human undifferentiated ESCs. The biantennary
N-glycans H5N4, H5N4F1, H5N4F2, S1H5N4, S1H5N4F1 and S2H5N4F2 as well as the
triantennary structures H6N5F1 and S1H6N5F1 were proposed as glycan-based
biomarkers for hepatocyte-like cells.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
N-glycosylation
dc.subject
MALDI-TOF mass spectrometry, capillary electrophoresis
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::543 Analytische Chemie
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Glycan-based biomarkers for the quality assurance in stem cell therapy
dc.contributor.firstReferee
Dr. Véronique Blanchard
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Rudolf Tauber
dc.date.accepted
2014-05-20
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000097071-0
dc.title.subtitle
Cell surface N-glycosylation of human stem cells and its changes during the
process of differentiation
dc.title.translated
Glykan-basierte Biomarker für die Qualitätssicherung in der Stammzelltherapie
de
dc.title.translatedsubtitle
N-Glykosylierung der Zelloberfläche humaner Stammzellen und ihre Änderung
während dem Prozess der Differenzierung
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000097071
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000015478
dcterms.accessRights.dnb
free
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open access