Transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) is a polymodal channel important for mechanotransduction in a variety of cells and tissues (Nilius et al. 2004, White JP et al. 2016). Interestingly, TRPV4 channels are specifically gated by movements of the membrane attached to the extracellular matrix when applying substrate deflection stimuli, but are insensitive to mechanical stimuli like membrane stretch or indentation (Servin-Vences et al., 2017). This suggests that TRPV4 channels may possess an unknown deflection-sensitive domain. By using the pillar arrays technique, a method that combines whole-cell patch clamp recordings and elastomeric pillar arrays, we sought to determine the minimal mechanosensing domain of TRPV4 that allows this channel, but not other TRP channels, to be gated by membrane deflection. We generated chimeric channels (TRPV4/TRPV1) in which protein domains from the mechanosensitive TRPV4 channels were substituted by the homologous domains of the non-mechanosensitive TRPV1 channel. We studied these chimeric channels by expressing them in N2aPiezo1-/- cells, which lack endogenous mechanosensitive currents (Moroni et al. 2018). We found that the minimal TRPV4 molecular segment essential for gating substrate deflection currents in TRPV4 is constituted by the 6th transmembrane and C-terminal domain of the channel. Moreover, since a series of mutations in TRPV4 located within the mechanosensitive domains have been linked to different pathophysiological conditions, we inserted point mutations in the TRPV4 clone to study their biophysical properties. We observed that mutations in L709M, A716S, and T740I modified mechanosensitivity and kinetics of TRPV4 currents. Thus, changes in the biophysical properties of TRPV4 variants present in the mechanosensing domain, might modify the interaction between the TRPV4 and the extracellular matrix. Thus, specific deficits in channel mechanosensitivity rather than other modes of gating could lead to TRPV4-related human diseases such as skeletal dysplasias and sensory neuropathies.
Der Transiente Rezeptor-Potential-Kationenkanal, Unterfamilie V, Mitglied 4 (TRPV4) ist ein polymodaler Kanal, der für die Mechanotransduktion in verschiedenen Zellen und Geweben wichtig ist (Nilius et al. 2004, White JP et al. 2016). Interessanterweise werden TRPV4 Kanäle spezifisch durch Bewegungen der Membran, die mit der extrazellulären Matrix verbunden ist, gesteuert, wenn Reize, die zur Deformation des Substrates führen, angewendet werden. Sie sind jedoch unempfindlich gegenüber mechanischen Reizen wie Membranstreckung oder Eindringen (Servin-Vences et al., 2017). Dies legt nahe, dass TRPV4 Kanäle möglicherweise über eine unbekannte deformationsempfindliche Domäne verfügen. Unter Verwendung der Säulenarray Technik, einer Methode, die Patch-Clamp-Aufzeichnungen der gesamten Zelle und elastomere Säulenarrays kombiniert, versuchten wir, die minimale mechanosensitive Domäne von TRPV4 zu bestimmen, die es diesem Kanal ermöglicht, aber nicht anderen TRP Kanälen, durch Membrandeformation gesteuert zu werden. Wir erzeugten chimäre Kanäle (TRPV4/TRPV1), bei denen Proteindomänen der mechanosensitiven TRPV4 Kanäle durch die homologen Domänen des nicht mechanosensitiven TRPV1 Kanals ersetzt wurden. Wir studierten diese chimären Kanäle, indem wir sie in N2aPiezo1-/- Zellen exprimierten, welche keine endogenen mechanosensitiven Ströme aufweisen (Moroni et al. 2018). Wir fanden heraus, dass das minimale TRPV4 Molekülsegment, welches für für die Steuerung von Substratdeformationsströmen in TRPV4 wesentlich ist, aus der 6. transmembranen und der C-terminalen Domäne des Kanals besteht. Darüber hinaus haben wir, da eine Reihe von Mutationen in TRPV4, die sich innerhalb der mechanosensitiven Domänen befinden, mit verschiedenen pathophysiologischen Zuständen in Verbindung gebracht wurden, Punktmutationen in TRPV4 Klone eingefügt. Dies diente zur Untersuchung ihrer biophysikalischen Eigenschaften. Wir beobachteten, dass Mutationen in L709M, A716S und T740I die mechanosensitive Reaktion und die Kinetik von TRPV4 Strömen veränderten. Somit könnten Veränderungen in den biophysikalischen Eigenschaften von TRPV4 Varianten, welche in der mechanosensitiven Domäne vorliegen, die Interaktion zwischen TRPV4 und der extrazellulären Matrix modifizieren. Spezifische Defizite in der mechanosensitiven Eigenschaft des Kanals könnten also eher als andere Steuerungsmechanismen zu TRPV4 bezogenen menschlichen Krankheiten wie skelettalen Dysplasien und sensorischen Neuropathien führen.
