Guanine-rich sequence binding factor 1 (Grsf1) is a heteronuclear ribonucleoprotein that binds to RNA and thus, takes part in the regulation of gene expression. Gene expression is regulated at different levels and involves transcriptional, post-transcriptional, translational and post-translational mechanisms. These regulatory networks enable cells and whole organisms to adapt to changing environmental conditions. Grsf1 has previously been reported to upregulate translation of glutathione peroxidase 4 (Gpx4) mRNA[1]. Since this enzyme plays an important role in embryonic brain development and as anti-oxidative enzyme, Grsf1 has also been implicated in these processes. In fact, studies on in vitro mouse embryogenesis have shown that RNAi-induced knockdown of Grsf1 expression leads to hypoplastic brain development but the molecular basis for these observations remains elusive. Although it has been hypothesized that Grsf1 might interact with other regulatory proteins, identification of Grsf1 binding proteins has been still pending. Moreover, due to the lack of Grsf1 knockout mice, it has not been explored whether the reported in vitro data on the biological functions of Grsf1 could be reproduced in vivo. This situation resulted in two major questions for the present dissertation, which have been worked on simultaneously. 1. Which intracellular proteins might function as putative Grsf1 binding partners? 2. Does systemic inactivation of the Grsf1 gene alter the phenotype of mice? To answer the first question, we employed the yeast 2-hybrid system and identified three different proteins as putative Grsf1 binding proteins: I) tetratricopeptide 7B (TTC7B), II) selenocysteine-binding protein 2 (SBP2) and III) SNF8 subunit of ESCRT-II (SNF8)]. Co-immunoprecipitation experiments using co-transfected human embryonic kidney cells (HEK) confirmed the postulated protein-protein interaction. To address the second question, we first generated floxed Grsf1 transgenic mice, in which exons 4 and 5 of the Grsf1 gene were flanked by recognition sequences for Cre-recombinase. These floxed Grsf1 mice were crossed with deleter mice expressing the Cre-recombinase under the control of the CMV promoter [B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J]. Offsprings expressed heterozygously a truncated version of the Grsf1 gene and the resulting dysfunctional Grsf1 mRNA was targeted for nonsense mediated decay. Intercrossing the resulting Grsf1+/- mice we obtain homozygous Grsf1-/- mice, in which the Grsf1 gene was inactivated in all tissues. Inactivation of the Grsf1 gene was demonstrated by quantification of the Grsf1 mRNA in a number of organs and by Western blot analysis in testis. We found that Grsf1-/- mice developed normally and did not show major phenotypic abnormalities. Although we observed subtle growth retardation in male Grsf1-/- mice, female individuals developed normally. The reproduction behavior of Grsf1-/- mice was normal and we did not detect restricted mobility or life expectancy. In the future, these Grsf1-/- mice can be tested in different animal disease models to explore the biological role of Grsf1 protein in mouse models of human diseases.
Der guanine-rich sequence binding factor 1 (GRSF1) ist ein heteronukleäres Ribonukleoprotein, welches an RNA bindet und damit regulatorisch an der Genexpression teilnimmt. Die Genexpression unterliegt in jedem ihrer Teilschritte Regulationsmechanismen, die inhibitorisch oder auch aktivierend eingreifen. Dazu zählen transkriptionelle, posttranskriptionelle, translationale und post-translationale Mechanismen, die den Zellen und damit den Organismen eine Anpassung an veränderte Umweltbedingungen ermöglichen. Bisher konnte gezeigt werden, dass GRSF1 die Translation der Gluthathionperoxidase 4 (Gpx4) mRNA hochreguliert [1]. Da die Gluthathionperoxidase 4 eine wichtige Rolle bei der embryonalen Hirnentwicklung und als anti-oxidatives Enzym spielt, wurde vermutet, dass GRSF1 ebenfalls an diesen Prozessen beteiligt ist. Bei Untersuchungen zur in vitro Embryogenese der Maus konnte gezeigt werden, dass ein RNAi-induzierter Knockdown der Grsf1-Expression zu einer hypoplastischen Hirnentwicklung führt. Dabei scheint Grsf1 mit anderen Proteinen zu interagieren. Zu Beginn meiner Arbeit lagen nur wenige Daten zur Interaktion von GRSF1 mit anderen Proteinen vor. Weiterhin konnte aufgrund des Fehlens von Grsf1- Knockout-Mäusen noch nicht untersucht werden, ob die in vitro Daten zur biologischen Funktion von Grsf1 in vivo reproduziert werden können. Aus dieser Datenlage ergaben sich für die vorliegende Dissertation zwei unterschiedliche Fragestellungen, die parallel zueinander bearbeitet wurden: 1. Welche intrazellulären Proteine fungieren als Bindungspartner für Grsf1? 2. Wie verändert eine systemische Inaktivierung des Grsf1-Gens den funktionellen Phänotyp von Mäusen. Um die erste Frage zu beantworten, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Hefe-2-Hybrid-Screen durchgeführt, bei dem drei unterschiedliche Proteine [Tetratricopeptid 7B (TTC7B), Selenocystein-binding Protein 2 (SBP2), SNF8 Subunit Of ESCRT-II (SNF8)] als potenzielle GRSF1-Bindungspartner identifiziert werden konnten. Ko-Immunopräzipitationen von GRSF1 und den potenziellen Bindungspartnern bestätigten diese Protein-Protein-Interaktion in kotransfizierten humanen embryonalen Nierenzellen (HEK). Um die zweite Frage zu beantworten, wurden zunächst gefloxte Grsf1-Mäuse hergestellt, bei denen die Exons 4 und 5 des Grsf1-Gens durch Erkennungssignale der Cre-Rekombinase flankiert wurden. Danach wurden diese gefloxten Grsf1-Mäuse mit deleter Mäusen gekreuzt, bei denen die Cre-Rekombinase unter Kontrolle des CMV Promotors [B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J] exprimiert wird. Dadurch wurde das Grsf1-Gen heterozygot funktionell inaktiviert. Anschließend erfolgte die Verpaarung der Grsf1+/- - Mäuse, wodurch homozygote Mäuse erzeugt wurden, bei denen das Grsf1-Gen systemisch (in allen Geweben) inaktiviert wurde. Die Inaktivierung des Grsf1-Gens und die damit verbundene Unfähigkeit der Mäuse zur Expression von Grsf1 konnte durch Quantifizierung der Grsf1-mRNA in einer Reihe von Organen und durch Western-Blot Analysen im Testis nachgewiesen werden. Wir konnten feststellen, dass Mäuse mit einer systemischen Inaktivierung des Grsf1-Gens sich normal entwickelten und kaum phänotypische Auffälligkeiten zeigten. Während wir bei den männlichen Grsf1-/- -Mäusen Unterschiede in der Körpergewichtsentwicklung im Vergleich zu entsprechenden Kontrolltieren beobachtet haben, entwickelten sich die weiblichen Mäuse normal. Ihr Reproduktionsverhalten war unauffällig und es gab keine Hinweise für eine eingeschränkte Mobilität und Lebenserwartung. In Zukunft können diese Grsf1-/- -Mäuse in verschiedenen Krankheitsmodellen getestet werden, um die mögliche Rolle von Grsf1 bei der Pathogenese bestimmter Erkrankungen zu untersuchen.
