Influenza A viruses and SARS-CoV-2 continue to pose a severe threat to public health. Both are zoonotic pathogens, having arisen from the close human-animal interface. For both viruses vaccines are available, however their continuous evolution leads to immune escape so that the vaccines need to be continuously evaluated, updated and re-administered. For influenza viruses, immunity is mainly directed against the head of the viral surface protein HA, which is continuously changing due to drift processes, resulting in strain-specific responses. For SARS-CoV-2, the spike glycoprotein on the surface, which facilitates receptor-binding is the target of current vaccines. For both viruses, the interest lies in the development of broadly reactive vaccines which can protect against current and future variants. A concept that has gained interest in the development of vaccines is the induction of non-neutralizing antibodies that can activate cellular effector-functions, like ADCC. Another important aspect is the induction of mucosal antibodies, in regard to the infection route of both viruses. New delivery platforms have also been evaluated and gained momentum during the SARS-CoV-2 pandemic, for example vector vaccines (e.g. Vakzevria®), or mRNA-based vaccines (e.g. Comirnaty®). New vaccine candidates are also continuously developed and evaluated, for example the nucleoprotein-based vaccine by Leroux-Roels et al. (2023), which is currently in clinical trials. The AAV-vectors used in this thesis have shown to be safe for the use in humans and have already been successfully evaluated for the use as vaccine vectors. Intriguingly, they can be repeatedly administered via the respiratory tract, following the natural infection route. For IAV, this thesis aimed to assess a possible synergistic effect of an AAV-vector vaccine combining the HA and NP antigens of the influenza virus A/California/7/2009pdm. Furthermore, it was hypothesized that, opposed to WIV vaccination, the AAV-vaccine could induce broadly reactive responses. Additionally, an AAV-vector vaccine carrying the HA of the group 2 virus A/Aichi/2/68 (H3N2) was assessed regarding the hypothesis of the induction of a broadened immune response in combination with the group 1 HA of A/California/7/2009pdm. Furthermore, the induction of a mucosal immune response along the route of application in the respiratory tract was evaluated. To measure these responses, humoral, i.e. neutralizing, broadly reactive, and FcγR-activating responses were evaluated in the sera of immunized C57BL/6 mice, mucosal responses were assessed in nasal washes and lung samples, and T-cells were measured in spleens. The protective efficiency was assessed by an experimental challenge of mice with homologous, heterologous and heterosubtypic virus. Here, it was shown that a bivalent AAV-HA/NP vaccine was superior to WIV immunization. In the serum of mice immunized with AAV-HA/NP, broadly reactive antibodies and FcγR-activating responses could be detected, while in nasal washes and lung samples mucosal antibodies were present. After a prime-boost i.n. application the vaccine was also capable of protecting mice from viral challenge of homologous, heterologous and heterosubtypic virus, which WIV did not. An AAV-vector vaccine containing a group 2 HA (H3) was evaluated for the first time in vivo and proved to be successful in inducing strain-specific antibodies and protecting against homologous challenge but did not induce broadly reactive antibodies. Another aim of this thesis was the design and evaluation of an AAV-vector vaccine against SARS-CoV-2, because earlier studies evaluating a similar AAV-vector vaccine against SARS-CoV showed promising results. In the course of this thesis, the vaccine was further adapted to the emerging VOCs. In addition to the overall immunogenicity, the hypothesized cross-reactivity and broadly reactive responses induced by the AAV-vaccines against the wildtype virus and the different VOCs were evaluated. The AAV-S-RBD vaccine was initially evaluated in mammalian cell culture models before the in vivo analyses were conducted. Initially, different mouse strains were evaluated, and for subsequent analyses BALB/c and NMRI mice were used. Sera, nasal washes, lung samples and spleens were analysed as mentioned for the mice in the IAV experiment. No viral challenge was conducted. For this part, an induction of variant-specific antibodies by the designed AAV-S-RBD vector could be shown, but it wasn’t robust. Interestingly, non-neutralizing antibodies induced by the AAV-S-RBD BA.2 vector could be shown to induce FcγR-activating responses. Overall, in this thesis AAV-vectors have been demonstrated to be promising vaccine candidates for the induction of broadly reactive immune responses against influenza viruses and SARS-CoV-2.
Influenza-A-Viren und SARS-CoV-2 stellen weiterhin eine ernsthafte Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. Beides sind zoonotische Erreger, die durch enge Kontakte zwischen Mensch und Tier entstanden sind. Für beide Viren sind Impfstoffe verfügbar, jedoch führt ihre ständige evolutive Weiterentwicklung zu Immunevasion, weshalb die Impfstoffe kontinuierlich überprüft und ggf. aktualisiert und erneut verabreicht werden müssen. Bei Influenza-Viren richtet sich die Immunität hauptsächlich gegen den Kopfbereich des viralen Oberflächenproteins HA, das aufgrund von Drift-Prozessen kontinuierlich verändert wird, was zu stamm-spezifischen Reaktionen führt. Bei SARS-CoV-2 ist das Spike-Glykoprotein auf der Virion-Oberfläche, welches die Rezeptorbindung ermöglicht, das Ziel der aktuellen Impfstoffe. Für beide Viren besteht das Interesse an der Entwicklung von breit reaktiven Impfstoffen, die vor aktuellen und zukünftigen Varianten schützen können. Ein Konzept, das in der Entwicklung von Impfstoffen Interesse gewonnen hat, ist die Induktion von nicht-neutralisierenden Antikörpern, die zelluläre Effektorfunktionen wie ADCC aktivieren können. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Induktion von Schleimhautantikörpern in Bezug auf den Infektionsweg beider Viren. Während der SARS-CoV-2-Pandemie wurden auch neue Impfstoffplattformen evaluiert und gewonnen an Bedeutung, wie z.B. Vektorimpfstoffe (z.B. Vakzevria®) oder mRNA-basierte Impfstoffe (z.B. Comirnaty®). Auch für Influenzaviren werden kontinuierlich neue Impfstoffkandidaten entwickelt und untersucht, wie z.B. der Nukleoprotein-basierte Impfstoff von Leroux-Roels et al. (2023), welcher mittlerweile in der klinischen Entwicklung ist. Die hier verwendeten AAV-Vektoren haben sich als sicher für den Einsatz beim Menschen erwiesen und wurden bereits erfolgreich als Impfstoffvektoren evaluiert. Interessanterweise können sie über den Atemweg wiederholt verabreicht werden und folgen so dem natürlichen Infektionsweg. Für IAV zielte diese Arbeit darauf ab, einen möglichen synergistischen Effekt eines AAV-Vektor-Impfstoffs zu untersuchen, der die HA- und NP-Antigene des Influenza-Virus A/California/7/2009pdm kombiniert. Darüber hinaus wurde die Hypothese aufgestellt, dass im Gegensatz zur WIV-Impfung der AAV-Impfstoff breit-reaktive Reaktionen hervorrufen könnte. Zusätzlich wurde ein AAV-Vektor-Impfstoffs, der das HA des Gruppe-2 Virus A/Aichi/2/68 (H3N2) trägt, im Hinblick auf die Hypothese der Induktion einer verbreiterten Immunantwort in Kombination mit dem Gruppe-1-HA von A/California/7/2009pdm untersucht. Auch wurde die Induktion von mukosaler Immunität entlang der Applikationsroute im Respirationstrakt untersucht. Zur Messung der Immunparameter wurden humorale, d.h. neutralisierende, breit-reaktive und FcγR-aktivierende Antikörper im Serum immunisierter C57BL/6 Mäuse bestimmt, mukosale Reaktionen wurden in Proben von nasaler Lavage und Lungen beurteilt, und T-Zellen wurden in Milzen gemessen. Die schützende Wirkung der Impfung wurde durch eine experimentelle Infektion der Mäuse mit homologen, heterologen und heterosubtypischen Viren evaluiert. Hier konnte gezeigt werden, dass ein bivalenter AAV-HA/NP-Impfstoff der WIV-Impfung überlegen war. Er konnte breit reaktive Antikörper, Schleimhautantikörper und FcγR-aktivierende Reaktionen induzieren. Nach einer i.n.-Anwendung im Prime-Boost-Schema war er auch in der Lage, Mäuse vor viralen Infektionen durch homologe, heterologe und heterosubtypische Viren zu schützen, was mit WIV nicht der Fall war. Ein AAV-Vektor-Impfstoff mit einem Gruppe-2-HA (H3) wurde erstmals in vivo evaluiert und erwies sich als erfolgreich bei der Induktion von stamm-spezifischen Antikörpern und dem Schutz vor homologer Infektion, induzierte jedoch keine breit reaktiven Antikörper. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war das Design und die immunologische Untersuchung eines AAV-Vektor-Impfstoffes gegen SARS-CoV-2, da frühere Studien, die einen ähnlichen AAV-Vektor-Impfstoff gegen SARS-CoV untersuchten, vielversprechende Ergebnisse zeigten. Im Verlauf dieser Arbeit wurde der Impfstoff weiter an die aufkommenden VOCs angepasst. Neben der Immunogenität wurden auch die hypothetische Kreuzreaktivität und die breit-reaktiven Reaktionen, die durch die AAV-Impfstoffe gegen das Wildtyp-Virus und die verschiedenen VOCs hervorgerufen wurden, analysiert. Der AAV-S-RBD-Impfstoff wurde zunächst in Zellkulturmodellen an Säugetierzellen evaluiert, bevor die in vivo-Analysen durchgeführt wurden. Zunächst wurden verschiedene Mausstämme evaluiert, und für anschließende Analysen wurden BALB/c- und NMRI-Mäuse verwendet. Seren, Proben von nasaler Lavage und Lungen, sowie Milzen der Mäuse wurden wie im IAV-Experiment analysiert. Es wurde keine experimentellen Infektionen durchgeführt. In diesem Teil konnte gezeigt werden, dass der entwickelte AAV-S-RBD Impfstoff stamm-spezifische Antikörper induziert. Interessanterweise konnte auch nachgewiesen werden, dass nicht-neutralisierende Antikörper, die durch den AAV-S-RBD-BA.2-Vektor induziert wurden, FcγR-aktivierende Reaktionen hervorrufen. Insgesamt haben sich AAV-Vektoren in dieser Arbeit als vielversprechende Impfstoffkandidaten für die Induktion breit reaktiver Immunantworten gegen Influenza-Viren und SARS-CoV-2 erwiesen.
