Das Melanom ist ein hoch maligner Tumor, der sich gegenüber gängigen Behandlungsmethoden weitgehend resistent erweist. Die Therapieresistenz beruht dabei vor allem auf der Entwicklung einer Apoptosedefizienz. Ziel dieser Arbeit war die Darstellung einzelner apoptotischer Regulationsprozesse im Gesamtkontext der Apoptose. Hierzu wurde einerseits die Wirksamkeit Apoptose- induzierender Stimuli auf Melanozyten und Melanomzellen quantifiziert und andererseits deren Einfluss auf die Expression einzelner Apoptoseregulatoren in kultivierten normalen humanen Melanozyten und Melanomzellen untersucht und verglichen. Die Melanomzelllinien zeigten zum Teil Resistenzen gegenüber der Apoptoseinduktion mit CH-11, IFN-γ (Interferon-γ), LPS (Lipopolysaccharide) und TNF-α (Tumornekrosefaktor-α), so dass zwischen resistenten und sensitiven Melanomzelllinien unterschieden werden konnte. In allen untersuchten Melanomzelllinien konnte im Gegensatz zu Melanozyten eine stärkere Expression der IAPs (inhibitors of apoptosis proteins) sowie von cFLIP (cellular FLICE inhibitory protein) und Smac (second mitochondria-derived activator of caspases) gefunden werden, wobei Livin nicht in allen Melanomzelllinien exprimiert wurde. Die allgemeine Überexpression der IAPs in Melanomzellen könnte durch die fehlende iNOS (induzierbare Stickstoffmonoxid- Synthase)-Expression begründet sein. Das proapoptotische AIF (apoptosis inducing factor) wurde hingegen in Melanomzellen schwächer als in Melanozyten exprimiert. Da sich zwischen sensitiven und resistenten Melanomzelllinien deutliche Expressionsunterschiede der anti- und proapoptotischen Proteine fanden, konnten mehrere Hypothesen zur Resistenzentwicklung aufgestellt werden. So könnte die Überexpression von Survivin für die Apoptoseresistenz bestimmter Tumoren verantwortlich sein. So fand sich in den untersuchten Zelllinien eine gegenläufige Expression des antiapoptotischen Survivin und des proapoptotischen Smac. In resistenten Melanomzelllinien lag eine starke Survivin- und schwache Smac- Expression vor. Survivin interagiert mit XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein) und unterbindet auf diesem Weg die apoptotische Wirkung von Smac. Es gibt in der vorangegangenen Literatur jedoch auch Hinweise für eine direkte Interaktion mit Smac. Weiterhin konnten in dieser Untersuchung der negative Einfluss von Survivin auf die AIF-Expression bestätigt werden. Survivin antagonisiert das proapoptotische Verhalten von AIF. Eine Erklärung für die Resistenzentwicklung ließ sich hierdurch jedoch nicht finden. AIF und Smac zeigten eine gegenläufige Expression, für die in der bisherigen Literatur durch eine direkte Interaktion keine Erklärung gefunden werden konnte. Übereinstimmend mit vorangegangenen Untersuchungen ließ sich auch für Livin und Smac eine gegenläufige Expression finden. In den Melanomzelllinien mit starker Livin- Expression fand sich nur eine schwache Smac-Expression. Livin dient bereits als therapeutischer Marker. Eine weitere Begründung für die Resistenzentwicklung von Melanomzellen könnte in der hohen cFLIP-Expression gefunden werden. Bei nur schwacher Expression von cFLIP zeigten sich die untersuchten Melanomzelllinien, bis auf eine Zelllinie, sensitiv gegenüber den Apoptosestimuli. Zur Untersuchung der Überexpression von CD95L auf die Apoptoseregulation wurde ein Tetracyclin-abhängiges Expressionssystem genutzt. Verwendet wurde die Melanomzelllinie SK-Mel-13, die mit dem Gen für CD95L stabil transfiziert wurde. Die Melanomzellen wurden dadurch für zusätzliche Apoptosestimuli signifikant sensitiviert, wobei sich die zweifach transfizierte Zelllinie SKM13-CD95L vor Aktivierung des Promotors mit Doxycyclin auf die Induktion der Apoptose resistent zeigte. Die überlebenden Zellen könnten auf Resistenz gegenüber dem selbst produzierten CD95L selektiert worden sein und somit die Apoptoseresistenz erklären. Es wird dabei von einer geringen Basalexpression des Transgens ausgegangen („leaky“-Expression). Die Resistenzentwicklung scheint dabei unabhängig von den Expressionsveränderungen der pro- und antiapoptotischen Proteine zu sein. Die antiapoptotischen Caspaseninhibitoren der Gruppe der IAPs, FLIP sowie die proapoptotischen Proteine AIF und Smac haben als Regulatoren der Apoptose entscheidenden Einfluss auf die Resistenzentwicklungen des malignen Melanoms. Mit Hinblick auf die Entwicklung therapeutischer Strategien wäre es interessant und wünschenswert die Ansätze dieser Arbeit weiter auszubauen. Nur durch die Aufklärung der genauen zellulären Abläufe können alte Therapieformen optimiert und neue Therapiekonzepte entwickelt werden.
Melanoma is a highly malignant tumor which is resistant to most usual therapies. This resistance is mainly due to a reduction of apoptosis in melanoma cells. Aim of this study was to analyze specific pathway steps of apoptosis in normal melanocytes and malignant melanoma cells. We therefore quantified and compared the efficacy of apoptosis inducing stimuli on melanocytes and melanoma cells. Furthermore we analyzed changes in expression of regulators of apoptosis in both cell types. Since the melanoma cells showed partially resistances to the induction of apoptosis by CH-11, IFN-γ (Interferon-γ), LPS (lipopolysaccharide) und TNF-α (tumor necrosis factor-α) we could distinguish resistant and sensitive melanoma cell lines. In contrast to melanocytes we found in all examined melanoma cells a stronger expression of IAPs (inhibitors of apoptosis proteins), of cFLIP (cellular FLICE inhibitory protein) and of Smac (second mitochondria-derived activator of caspases). However, Livin was not expressed in all melanoma cell lines. The overall increased expression of IAP in melanoma cells may be explained by a missing iNOS (inducible nitric oxide synthase)-expression in these cells. On the other hand, the pro-apoptotic AIF (apoptosis inducing factor) was expressed much weaker in melanoma cells than in normal melanocytes. As we found strong distinctions of expression of anti- and proapoptotic proteins between sensitive and resistant melanoma cells, we can formulate several hypothesis that may explain how resistance of melanoma cells to induction of apoptosis may have developed. One explanation could be an overexpression of the anti-apoptotic protein Survivin. We found a reciprocal expression of antiapoptotic Survivin and of proapoptotic Smac. Within the resistant melanoma cell lines we observed a strong expression of Survivin and a weak expression of Smac. Survivin inhibits the apoptotic impact of Smac by interacting with XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein). Furthermore it inhibits AIF- expression and antagonizes the pro-apoptotic effect of AIF. Yet, this mechanism does not completely explain the development of resistance of melanocytes towards apoptosis induction. AIF and Smac showed reciprocal expression for which up to today there has not been found a proper explanation. The reciprocal expression of Livin and Smac on the other hand has been described by others previously. In this study, melanoma cell lines with strong Livin expression showed only mild Smac expression. Livin is already being used as a diagnostic marker. Another reason for the development of resistance to apoptosis may be the high cFLIP expression on melanoma cells. When showing a weak expression of cFLIP all but one of the melanoma cell lines we investigated, were found to be sensitive to stimuli of apoptosis. In order to investigate the effect of CD95L-overexpression on apoptosis regulation we used a tetracyclin regulated expression system. SK-Mel-13, a melanoma cell line that is transfected with the gene encoding for CD95L, was used for this investigation. Through this transfection the melanoma cells became more sensitive to apoptosis stimuli. The twice transfected cell line SKM13-CD95L in contrast was – prior to activation the promotor gene of apoptosis with doxycycline - resistant to apoptosis induction. A possible explanation may be that the survived cell lines had been selected in advance due to their resistance to their own CD95L. A feeble basic expression of the transgene is quite assumable („leaky“-expression). The development of resistance seemed to develop independently from altered expression of pro- and anti-apoptotic proteins. The anti-apoptotic IAPs and FLIP as well as the pro-apoptotic proteins AIF and Smac do have a major influence on regulating apoptosis and on the development of resistance in malignant melanoma cells. Further studies will be needed to understand the exact cellular and molecular mechanisms of apoptosis in order to optimize and develop new strategies to treat malignant melanoma.
