A novel methodology to identify DNA repair deficiencies by means of genomic scars generated in the course of antibody diversification

Abstract

I developed a methodology to study class-switch recombination (CSR) genomic scars, also called switch-joints, in B cell DNA. I applied this methodology to study a recently discovered antibody diversification process and the DNA repair malfunction in humans and mice. CSR is the diversification process by which the antibody changes the isotype. It is a deletional recombination occurring in the antibody gene between long repetitive intronic sequences called switch regions. During CSR, activation-induced cytidine deaminase (AID) promotes random breaks in two switch regions, later joined by the main DNA repair pathways. Thus, the study of switch-joints in polyclonal B cells allows the analysis of diverse genomic scars. B cells can also diversify their antibody by a recently discovered process integrating foreign DNA fragments, called inserts, in the switch regions. Inserts have been analyzed in antibody transcripts, but the mechanism of their generation remains unknown. This methodology, called SWIBRID, involves the amplification, long-read sequencing, and computational analysis of switch-joints. Here, I designed a PCR to amplify human and mouse switch-joints using as few as three primers. In addition, published switch-joint analyses use read count as a metric for clonal diversity. We demonstrated that the read count does not reflect the unique clone composition and used this insight to identify unique B cell clones by SWIBRID and confirmed its proper performance using an in silico dataset. Firstly, SWIBRID was used to analyze the incorporation of inserts in switch-joints. Results of in vitro and in vivo modulation of classical and alternative end-joining DNA repair pathways in human samples suggested that alternative end joining is involved in insert acquisition. Also, AID off-targets telomeres and a similar case may occur with telomerase in the switch regions. Thus, I inhibited telomerase in in vitro activated human B cells and found its potential involvement in incorporating a specific insert type. Secondly, we theorized that early detection of diseases like cancer might be aided by DNA repair malfunction analysis via SWIBRID. I studied DNA repair by analyzing genomic scars. While challenging in somatic cells due to the random occurrence of DNA breaks in the genome, B cells serve as a subject for this analysis since they acquire breaks during CSR. Four criteria were identified to describe the switch-joint genomic scars, e.g., homology used for repair. BRCA1, Ligase 4, NIPBL, ATM, and AID deficient human patients and BRCA1, 53BP1, Rif1 and Ligase 4 mouse CH12 knockouts were analyzed using a principal component analysis (PCA). Using only those features, the PCA separated the DNA repair deficient from the healthy samples. Results show that healthy- and disease-specific breakpoint profiles may serve as a DNA repair biomarker. In the future, this pipeline could be used to predict DNA repair deficiencies linked to cancer development or immunodeficiencies.

In dieser Arbeit habe ich eine Methode entwickelt, um durch Class-Switch-Rekombination (CSR) erzeugte DNA Narben (Switch-Joints), in B-Zellen zu analysieren, um die Antikörper-Diversifizierung sowie DNA-Reparaturfehlfunktionen zu erforschen. CSR beschreibt den Prozess, durch den ein Antikörper sein Isotyp ändert. Es handelt sich dabei um eine deletionale Rekombination zwischen langen, repetitiven intronischen Sequenzen (Switch-Regionen) im Antikörper-Gen. Während der CSR fördert die activation-induced cytidine deaminase (AID) zufällige Brüche in zwei Switch-Regionen, die später durch DNA-Reparatur verbunden werden. Switch-Joints in polyklonalen B-Zellen eignen sich daher sehr für die Analyse von DNA-Narben. B-Zellen können ihre Antikörper auch durch einen anderen Prozess diversifizieren, bei dem fremde DNA-Fragmente (Inserts) in die Switch-Regionen integriert werden. Der Mechanismus ihrer Entstehung ist aber noch unbekannt. Die von mir entwickelte Methode heißt SWIBRID und umfasst die Amplifikation mit drei Primern, Long-Read-Sequenzierung und computergestützte Analyse von humanen sowie murinen Switch-Joints. Entgegen bislang publizierter Studien konnten wir zeigen, dass nicht die Anzahl der Reads der wahren Zusammensetzung der Klone entspricht und mit Hilfe von SWIBRID eindeutige B-Zell-Klone identifizieren. Zuerst wurde SWIBRID verwendet, um die Integration von Inserts in Switch-Joints zu analysieren. Die Ergebnisse der in vitro- und in vivo-Modulation der klassischen und alternativen End Joining-DNA-Reparatur in humanen Proben legten nahe, dass Letztere an der Integration beteiligt ist. Außerdem wurden Telomere als eines der Off-Targets von AID beschrieben, und ein ähnliches Phänomen könnte auch bei der Telomerase in den Switch-Regionen auftreten. In vitro Inhibition der Telomerase in aktivierten humanen B-Zellen zeigte, dass sie für den Einbau einer bestimmten Art von Insert verantwortlich sein könnte. Weiterhin stellte ich die Hypothese auf, dass SWIBRID für die Früherkennung von Krebs durch die Analyse von Fehlfunktionen der DNA-Reparatur genutzt werden könnte. B-Zellen eignen sich im Vergleich zu somatischen Zellen besonders gut für diese Analyse, da sie während der CSR, gerichtete DNA-Brüche erleiden. Basierend auf vier ausgewählten Kriterien wurden DNA-Narben in BRCA1, Ligase 4, NIPBL, ATM und AID defizienten humanen Proben sowie in BRCA1, 53BP1, Rif1 und Ligase 4 murinen CH12 Knock-out Zellen mit einer Hauptkomponentenanalyse (PCA) analysiert. Die PCA zeigte, dass die vier Merkmale ausreichten, um die Proben mit DNA-Reparatur Defiziten von den gesunden Proben zu unterscheiden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass es gesunde und krankheitsspezifische Bruchpunktprofile gibt, die als DNA-Reparatur-Biomarker dienen könnten. In Zukunft könnte diese Pipeline zur Vorhersage von Fehlern in der DNA-Reparatur im Zusammenhang mit Krebs oder Immundefekten genutzt werden.