Granulomatose mit Polyangiitis (GPA) ist eine chronische Autoimmunerkrankung, die durch eine Entzündung der kleinen Blutgefäße gekennzeichnet ist und mit Bildung von Granulomen in vielen verschiedenen Organsystemen assoziiert ist, einschließlich der Lunge und der Nieren. Kennzeichnend für diese Krankheit sind anti-neutrophile zytoplasmatische Antikörper (ANCAs), die in den meisten Fällen gegen das Antigen Proteinase-3 (PR3) gerichtet sind. Die genaue Ursache der GPA ist noch nicht vollständig geklärt und die zugrunde liegende Immunpathogenese noch nicht vollständig verstanden, aber viele Mechanismen des angeborenen sowie des adaptiven Immunsystems scheinen, eine wichtige Rolle zu spielen. In den letzten Jahren ist die Rolle von Neutrophil Extracellular Traps (NETs) in den Fokus der Forschung gerückt. NETs sind netzartige Strukturen, die aus einem DNA-Gerüst bestehen und verschiedene Proteine, wie Neutrophile Elastase (NE) und Myeloperoxidase (MPO), enthalten. Neutrophile Granulozyten wurden als Quelle dieser NETs identifiziert. Sobald sie auf Bakterien treffen, setzen Granulozyten NETs frei, um die Infektion zu bekämpfen. DNAse1, eine Endonuklease im Blutserum, ist u.a. für den Abbau dieser NETs verantwortlich. In einer Vielzahl von verschiedenen Krankheiten, einschließlich maligner Erkrankungen, Infektionen und Autoimmunerkrankungen, konnte gezeigt werden, dass eine Untergruppe von Neutrophilen, die sog. Low Density Granulocytes (LDGs), eine entscheidende Rolle bei der fehlregulierten NETs-Produktion spielt. Ziel dieser Studie war, die Rolle von neutrophilen Granulozyten und NETs in der Entwicklung von GPA eingehender zu untersuchen. Wir haben daher zunächst die Oberflächenmarker von Neutrophilen und anderen Immunzellen mittels FACS charakterisiert und ihre Fähigkeit zur Produktion von NETs untersucht sowie die Menge von NETs im Blutplasma mittels ELISA gemessen. Zusätzlich wurde die Fähigkeit von Patientenserum zur Degradation von NETs mit Hilfe eines DNAse-Assay quantifiziert, der auf der Fluoreszenzabnahme von PicoGreenTM basiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Patienten mit GPA im Vergleich zu gesunden Spendern (HD) deutlich erhöhte Anzahl von LDGs im peripheren Blut aufwiesen. Diese LDGs zeigten einen stärker aktivierten und unreifen Phänotyp verglichen mit gesunden Kontrollen. Die Kapazität von Neutrophilen zur Freisetzung von NETs und die Menge zirkulierender NETs im Blut war vergleichbar mit denen gesunder Spender. Allerdings war die Degradation von NETs in vitro bei GPA-Patienten signifikant einge-schränkt, was mit klinischen und serologischen Aktivitätsmarkern korrelierte. Zusätzlich konnten wir eine Aktivierung von myeloiden dendritischen Zellen (mDCs) mit erhöhter Expression von OX40L und erhöhte Frequenzen zirkulierender Plasmablasten feststellen, was darauf hinweist, dass verschiedene Zelltypen zur Pathogenese von GPA beitragen. Zusammenfassend deuten unsere Daten darauf hin, dass neutrophile Granulozyten und NETs an der Pathogenese von GPA beteiligt sind. LDGs waren in erhöhter Frequenz im peripheren Blut nachweisbar und wiesen einen unreifen und aktivierten Phänotyp auf. Obwohl zirkulierende NETs bei GPA nicht erhöht nachweisbar waren, konnte eine eingeschränkte Degradierung von NETs nachgewiesen werden. Da NETs spezifische Zielantigene bei GPA enthalten, z.B. PR3, NE oder MPO, könnte eine Exposition von NETs eine Quelle von Autoantigenen darstellen, die mit der Produktion von Autoantikörpern verbunden sein könnte.
Granulomatosis with polyangiitis (GPA) is a chronic autoimmune disease characterized by inflammation of the small vessels and associated with the formation of granulomas in many different organ systems, including the lung and kidneys. Hallmark of this disease are anti-neutrophil cytoplasmatic antibodies (ANCAs), in most cases against the antigen Proteinase-3 (PR3). The exact cause of GPA is not yet fully understood and the underlying immunopathogenesis is still unclear, but it appears that many mechanisms from both the innate and the adaptive immune system play an important role. In recent years the role of Neutrophil Extracellular Traps (NETs) has gained attention. These NETs are web-like structures composed of a DNA-scaffold and containing different proteins such as neutrophil elastase (NE) and myeloperoxidase (MPO). Neutrophil granulocytes have been identified as the source of these NETs. Once they encounter bacteria granulocytes extrude NETs to combat the infection. DNAse1, an endonuclease found in the blood serum, is i.a. responsible for the degradation of NETs. In a variety of different diseases, including malignancies, infectious and autoimmune diseases, one subset of neutrophils, the Low Density Granulocytes (LDGs), has been shown to play a vital role in the dysregulated production of NETs. In this study we aimed to examine further the role of neutrophil granulocytes and NETs in the development of GPA. Therefore, we identified the surface markers of neutrophils using FACS. We also examined the ability of neutrophils to produce NETs and investigated the level of NETs directly in the blood plasma of patients using an ELISA. The NET-degradation ability of patient sera was also quantified by using a DNAse-Assay, based on the quenching of PicoGreenTM. Our research shows that individuals with GPA had notably elevated levels of LDGs in peripheral blood when compared to healthy donors (HD). These LDGs showed a more activated and immature phenotype. The capacity of neutrophils to produce NETs and the amount of circulating NETs in the bloodstream were comparable to those of healthy donors. However, the degradation of NETs in vitro in GPA-patients was significantly impaired and this correlated with clinical and serological markers. Additionally, we could show an activation of myeloid dendritic cells (mDCs) with an elevated expression of OX40L and higher frequencies of circulating plasmablasts, indicating that different cell types contribute to pathogenesis of GPA. In summary, our data support the notion of neutrophil granulocytes and NETs contributing to the pathogenesis of GPA. LDGs were detectable in increased frequency in peripheral blood and exhibited an immature and activated phenotype. Although circulating NETs were not significantly increased in GPA, a limited degradation of NETs could be demonstrated. Since NETs contain specific target antigens in GPA, such as PR3, NE, or MPO, exposure to NETs could represent a source of autoantigens that may be associated with the production of autoantibodies.
