The knowledge of drug metabolism is fundamental for scientific fields where a comprehensive understanding of steroid metabolism is of high relevance, including but not only limited to anti-doping studies, endocrinology, forensic toxicology, and safety assessment in drug development. This work concentrates on the metabolism of anabolic androgenic steroids (AAS) in both in vivo and in vitro models, with a specific focus on the AAS compounds testosterone (T), metandienone (MD), methyltestosterone (MT), clostebol (CLT), dehydrochloromethyltestosterone (DHCMT), and methylclostebol (CLMT) due to their structural similarities. It introduces new alternative models for studying AAS metabolism and provides valuable knowledge on metabolic properties based on chemical structural characteristics, offering the possibility for the enhancement of AAS detection. Firstly, in order to have a deep understanding of the A-ring reduction in MD, isolated enzyme assays (AKR1C2, AK1C3, ALR1C4, and AKR1D1) were performed. The results obtained substantiate the sequence of A-ring reduction in MD, as previously suggested in the literature [93, 136, 137], i.e., the 4,5-double bond is reduced first, then the 3 oxo group, and finally the 1,2-double bond. Moreover, it appears that AKR1C2, AKR1C3, and AKR1C4 exhibited varying stereoselectivity in catalyzing the 3-oxo reduction in 5α- or 5β-DHMD. AKR1C2 and AKR1C4 showed both 3α- and 3β-HSD activities, whereas AKR1C3 functioned as 3α-HSD only. The sequence of A-ring reduction provided valuable insights for the metabolic pathway analysis for subsequent in vitro studies in human skin cells. The metabolism of T, MT, CLT, and CLMT by keratinocytes and fibroblasts derived from human foreskins produced metabolites with partially or fully reduced A-ring. However, no metabolites of MD or DHCMT could be detected. The metabolite profiles suggest that 3α-HSD, 3β-HSD, and 5α-reductase activities play important roles in steroid metabolism by human keratinocytes and fibroblasts, whereas 17β HSD activity is weak. The stereochemistry of fully reduced metabolites (i.e., 3α,4α,5α-THCLT, 3β,4α,5α-THCLT, 3α,4α,5α-THCLMT, and 3β,4α,5α-THCLMT) of CLT and CLMT was newly identified and confirmed in this study. Differences in the chemical structures of compounds appear to affect A-ring reduction order and cellular metabolic capacities, especially the chlorine group at position 4. Keratinocytes appear to have a higher metabolic capability for compounds containing a chlorine substituent in position 4, whereas the opposite is true in fibroblasts. The medaka embryo model was used for the first time as an alternative model for in vivo studies of AAS. There were four metabolites detected after incubation of medaka embryos with MD, including 6βOH-MD and 5β-DHMD as well as tentatively assigned 18OH-MD and 16OH-MD. These metabolites have also been reported in previous human administration studies [136, 177, 180]. In comparison to the in vitro models, the medaka embryo model allows for simultaneous analysis of biotransformation and potential toxicity. Given the similar outcomes with human administration studies, medaka embryos may serve as an alternative model to identify potential metabolites for human biotransformation of doping-relevant compounds. Investigations on the metabolism of [13C3]-T and MT in the medaka embryo model show that the main metabolic reactions for both two substrates include hydrogenation of the 4,5-double bond and reduction of the 3-oxo function. Additionally, the oxidation of 17β-hydroxy group in [13C3]-T was also observed. The metabolites observed indicate the activities of steroid 5α-reductases, steroid 5β-reductases, 3α-HSD, 3β-HSD, and 17β-HSD in medaka embryos. 3β,5α- and 3α,5β-isomers were detected as the main fully reduced A-ring metabolites in both incubations. However, this study only showed preliminary results, further studies are necessary. In conclusion, appropriate in vivo and in vitro models were evaluated and used for metabolic studies of AAS. The findings presented in this thesis hold significant implications not only for doping control analysis, but also for other scientific areas where a comprehensive understanding of steroid metabolism is highly relevant, such as endocrinology, forensic toxicology, and safety assessment in drug development.
Die Kenntnis des Wirkstoffmetabolismus ist von grundlegender Bedeutung für wissenschaftliche Bereiche, in denen ein umfassendes Verständnis des Steroidstoffwechsels von großer Relevanz ist, z. B. für Anti-Doping-Studien, die Endokrinologie, die forensische Toxikologie und die Sicherheitsbewertung bei der Arzneimittelentwicklung. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Untersuchung des Metabolismus von anabolen androgenen Steroiden (AAS) sowohl in in vivo- als auch in in vitro-Modellen, wobei der Schwerpunkt auf den Verbindungen Testosteron (T), Metandienon (MD), Methyltestosteron (MT), Clostebol (CLT), Dehydrochlormethyltestosteron (DHCMT) und Methylclostebol (CLMT) liegt. Es werden neue alternative Modelle für die Untersuchung des AAS-Stoffwechsels vorgestellt und wertvolle Erkenntnisse über die metabolischen Eigenschaften auf der Grundlage der chemischen Strukturmerkmale gewonnen, die eine Verbesserung des AAS-Nachweises ermöglichen. Um ein tieferes Verständnis der A-Ring-Reduktion in MD zu erhalten, wurden zunächst Tests mit isolierten Enzymen (AKR1C2, AK1C3, ALR1C4 und AKR1D1) durchgeführt. Die erzielten Ergebnisse bestätigen die Reihenfolge der A-Ring-Reduktion in MD, wie sie zuvor in der Literatur vorgeschlagen wurde [93, 136, 137], d.h. zuerst wird die 4,5-Doppelbindung reduziert, dann die 3-Oxo-Gruppe und schließlich die 1,2-Doppelbindung. Außerdem scheinen AKR1C2, AKR1C3 und AKR1C4 eine unterschiedliche Stereoselektivität bei der Katalyse der 3-Oxo-Reduktion in 5α- oder 5β-DHMD aufzuweisen. AKR1C2 und AKR1C4 zeigten sowohl 3α- als auch 3β-HSD-Aktivitäten, während AKR1C3 nur als 3α-HSD fungierte. Die Sequenz der A-Ring-Reduktion lieferte wertvolle Erkenntnisse für die Analyse der Stoffwechselwege für nachfolgende in vitro-Studien in menschlichen Hautzellen. Der Metabolismus von T, MT, CLT und CLMT durch Keratinozyten und Fibroblasten aus menschlicher Vorhaut produzierte Produkte mit teilweise oder vollständig reduziertem A-Ring. Es konnten jedoch keine Metabolite von MD oder DHCMT nachgewiesen werden. Die Metabolitenprofile deuten darauf hin, dass 3α-HSD-, 3β-HSD- und 5α-Reduktase-Aktivitäten eine wichtige Rolle beim Steroidmetabolismus durch menschliche Keratinozyten und Fibroblasten spielen, während die 17β-HSD-Aktivität gering war. Die Stereochemie der vollständig reduzierten Produkten (d. h. 3α,4α,5α-THCLT, 3β,4α,5α-THCLT, 3α,4α,5α-THCLMT und 3β,4α,5α-THCLMT) von CLT und CLMT wurde in dieser Studie neu identifiziert und bestätigt. Unterschiede in den chemischen Strukturen der Verbindungen scheinen die Reihenfolge der A-Ring-Reduktion und die zellulären Stoffwechselkapazitäten zu beeinflussen, insbesondere die Gegenwart eines Chlorsubstituenten an Position 4. Keratinozyten scheinen eine höhere Stoffwechselfähigkeit für Verbindungen mit derartigen Chlorsubstituenten zu haben, während bei Fibroblasten das Gegenteil der Fall ist. In dieser Arbeit wurde das Medaka-Embryo-Modell zum ersten Mal als alternatives Modell für in vivo-Studien von AAS verwendet. Nach der Inkubation von Medaka-Embryonen mit MD wurden vier Metaboliten nachgewiesen, darunter 6βOH-MD und 5β-DHMD, zusätzlich wurden 18OH-MD und 16OH-MD anhand ihrer Fragmentierung identifiziert und postuliert. Diese Metaboliten wurden auch in früheren Studien zur Verabreichung an den Menschen festgestellt [136, 177, 180]. Im Vergleich zu den in vitro-Modellen ermöglicht das Medaka-Embryo-Modell eine gleichzeitige Untersuchung der Biotransformation und der potenziellen Toxizität. Angesichts der vergleichbaren Ergebnisse mit Studien zur Verabreichung beim Menschen könnten Medaka-Embryonen als alternatives Modell zur Identifizierung potenzieller Metaboliten für die Biotransformation von dopingrelevanten Verbindungen beim Menschen dienen. Weitere Untersuchungen zum Stoffwechsel von [13C3]-T und MT im Medaka-Embryo-Modell zeigen, dass die wichtigsten Stoffwechselreaktionen für beide Substrate die Hydrierung der 4,5-Doppelbindung und die Reduktion der 3-Oxo-Funktion umfassen. Darüber hinaus wurde auch die Oxidation der 17β-Hydroxygruppe bei [13C3]-T beobachtet. Die beobachteten Metabolite weisen auf die Aktivitäten von Steroid-5α-Reduktasen, Steroid-5β-Reduktasen, 3α-HSD, 3β-HSD und 17β-HSD in Medaka-Embryonen hin. 3β,5α- und 3α,5β-Isomere wurden als die wichtigsten vollständig reduzierten A-Ring-Metaboliten in beiden Inkubationen nachgewiesen. Diese Studie zeigte jedoch nur vorläufige Ergebnisse, weitere Studien sind notwendig. Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß geeignete in vivo- und in vitro-Modelle evaluiert und für Stoffwechselstudien von AAS verwendet wurden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse sind nicht nur für die Dopingkontrollanalyse von Bedeutung, sondern auch für andere wissenschaftliche Bereiche, in denen ein umfassendes Verständnis des Steroidstoffwechsels von großer Bedeutung ist, z. B. für die Endokrinologie, die forensische Toxikologie und die Sicherheitsbewertung bei der Arzneimittelentwicklung.
