Einleitung: Ziel der immunzytochemischen Versuche war es, Anoctamin-4 (ein calciumabhängiger Kationenkanal) und Bestrophin-1 (ein calciumabhängiger Chloridkanal) sowie verschiedene Mutanten dieser Ionenkanäle hinsichtlich ihrer zellulären Lokalisation zu untersuchen, um beide Ionenkanäle besser zu charakterisieren und um langfristig kausale Therapieansätze für die resultierenden Krankheiten (verschiedene Epilepsien für Anoctamin-4-Mutationen und Morbus Best für Bestrophin-1-Mutationen) zu entwickeln.
Methodik: An HEK293-Zellen wurde immunzytochemisch das Verhalten von Anoctamin-4-Wildtyp und sieben verschiedenen Mutanten hinsichtlich ihrer Expression in der Zellmembran, sowie ihrer Lokalisation in frühen Endosomen und Lysosomen, untersucht. Für Bestrophin-1 wurden iPS-RPE-Zellen verwendet, die entweder eine endogene Mutation trugen oder mit Bestrophin-1-Wildtyp oder mit der Mutation T6P transfiziert wurden und mit Antikörpern gegen den Zellmembranmarker β-Catenin, gegen frühe Endosomen und Lysosomen, sowie gegen den L-Typ-Calciumkanal CaV1.3 gefärbt wurden. Weiterhin wurde der Einfluss von Natriumphenylbutyrat als Chaperon auf den mutationsbedingten Trafficking-Defekt für beide Proteine untersucht. Die Assoziation von Anoctamin-4 und Bestophin-1 zu den verschiedenen zellulären Antigenen wurde durch die Errechnung des Pearson’s Korrelationskoeffizienten erfasst.
Ergebnisse: Anoctamin-4-Wildtyp wird zu 56% in der Zellmembran exprimiert, der restliche Anteil liegt im Zytosol vor. Die untersuchten Anoctamin-4-Mutationen führen zu einer signifikant geringeren Expression von Anoctamin-4 in der Zellmembran und in den frühen Endosomen im Vergleich zum Wildtyp. Bezüglich der Lokalisation in den Lysosomen ergibt sich kein signifikanter Unterschied zwischen Anoctamin-4-Wildtyp und den Mutationen. Natriumphenylbutyrat hat keine signifikanten Effekte auf die Zellmembranexpression der Anoctamin-4-Mutanten. Die Datendichte zur Immunzytochemie an den iPS-RPE-Zellen ist nicht ausreichend, um fundierte konkrete Schlussfolgerungen zu Bestrophin-1 zu ziehen.
Diskussion: Zwar führen die untersuchten Anoctamin-4-Mutationen zu einer signifikant geringeren Expression von Anoctamin-4 in der Zellmembran und in den frühen Endosomen im Vergleich zum Wildtyp, jedoch ist der Trafficking-Defekt geringer ausgeprägt als die in der Literatur beschriebenen mutationsbedingten Funktionseinschränkungen von Anoctamin-4 als Kationenkanal. Eine Ursache für diese Diskrepanz könnten Strukturmodellanalysen liefern, die für die Anoctamin-4-Mutationen eine geringere Stabilität, teilweise eine Ladungsänderung und teilweise eine Lokalisation nahe der Calciumbindungsstelle vorhersagten. Die für Bestrophin-1 beschriebenen mutationsbedingten Effekte der reduzierten Zellmembranexpression und der Akkumulation im endolysosomalen System konnten nur teilweise repliziert werden. Ursächlich dafür scheint das noch nicht ausreichend optimierte Färbeprotokoll an den anspruchsvollen iPS-RPE-Zellen zu sein.
Introduction: The purpose of the study is to get deeper insights into the cellular localisation of anoctamin-4 (a Ca2+-dependent cation channel) and bestrophin-1 (a Ca2+-dependent Cl--channel) by means of immunocytochemistry – in order to characterize different mutant forms of these ion channels and generate hypotheses on putative pathomechanisms for anoctamin-4 or bestriohin-1 associated hereditary diseases. In the long-term, this could help develop possible therapeutic strategies against the resulting channelopathies (different forms of epilepsies for anoctamin-4-mutations and Best Vitelliform Macular Dystrophy for bestrophin-1-mutations).
Methods: HEK293 cells were transfected with wildtype anoctamin-4 and seven mutations (with known cases of hereditary epilepsy) and stained against cell surface (pan-cadherin), endosomal (early endosome antigen 1, EEA1) and lysosomal (lysosome-associated membrane protein 1, Lamp1) markers. iPS-RPE-cells were used for immunocytochemistry to study endogenously expressed mutant bestrophin-1 as well as transfected wildtype bestrophin-1 and the co-transfected mutation T6P. iPSC-RPE were analysed for subcellular bestrophin-1 localisation using co-staining against early endosomal (EEA1) and lysosomal (Lamp1) markers, against the cell membrane marker β-Catenin and against CaV1.3 (a L-type Ca2+-channel known to interact with bestrophin-1). Furthermore, the effect of the molecular chaperone 4-phenylbutyric acid (4PBA) on the trafficking defects of both ion channels was assessed. The co-localization of the two ion channels with the cellular antigens was calculated using the Pearson‘s correlation coefficient.
Results: Wildtype anoctamin-4 showed a cell surface expression of 56%, the rest of anoctamin-4 appeared intracellular. The mutations lead to a reduced expression of anoctamin-4 in the cell membrane and in early endosomes, when compared to the wildtype. No changes were observed for the localisation in lysosomes between wildtype anoctamin-4 and its mutant forms. 4PBA had no significant effect on the cell surface expression of mutant anoctamin-4. The data collected from staining the iPSC-RPE was not sufficient to make definite conclusions for bestrophin-1.
Discussion: The observed trafficking defects of mutant anoctamin-4 in immunocytochemistry is relatively mild when compared to the severe effects of the mutants on the channel activity of anoctamin-4, as described in the literature. Structural analysis of anoctamin-4 might explain this difference – as there was a predicted destabilized folding for all mutations, and for some mutations a localisation near the calcium binding site. Bestrophin-1 mutants are supposed to show a reduced cell surface expression and to accumulate in the endolysosomal system. The conducted immunocytochemistry only partially confirms the effects described in the literature. This is most probably caused by a currently sub-optimal staining protocol for the complicated handling of the iPS-RPE-cells.
