Die positive Wirkung von Low Intensity Pulsed Ultrasound (LIPUS) auf die Frakturheilung konnte bereits in mehreren Studien nachgewiesen werden. Genaue Wirkmechanismen und optimale Stimulationsparameter sind momentan noch nicht bekannt. Ziel dieser Studie war es die Effekte von Stimulationsdauer, Intensität und Alter der Spendertiere auf die osteogene Differenzierung von mesenchymalen Stromazellen aus Ratten (rMSCs) nach Stimulation mit einem fokussierten Ultraschall (Focused Low Intensity Pulsed Ultrasound, FLIPUS) zu betrachten. Für die Isolation der rMSCs wurden die Femurknochen von weiblichen Sprague Dawley Ratten im Alter von 3 Monaten (jung) und 12 Monaten (alt) verwendet. Nach Kultivierung der Zellen bis zur Passage 2 wurden sie pro Tag über 20 Minuten mit einer räumlich und zeitlich gemittelten Intensität von 11,7 mW/cm2 (ISATA) bzw. mit 44,5 mW/cm2 beschallt. Je nach Gruppenzuteilung erfolgte die Stimulation über 7 bzw. 14 Tage. Für alle Gruppen gab es eine entsprechende nicht stimulierte Kontrollgruppe. Folgende Stimulationsparameter wurden verwendet: Frequenz: 3,6 MHz, Pulszyklus: An/Aus-Verhältnis 27,8 %, Pulswiederholungsrate: 100 Hz. Nach Beendigung der Stimulation wurden die osteogenen Marker Osteocalcin und Runt-Related Transcription Factor 2 (RUNX2) mittels quantitativer Real Time-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) und die extrazelluläre Kalzifikation mit Hilfe der Alizarin Red S Färbung bestimmt. Für alle Spendertiere wurde zudem ein Charakterisierungsversuch im Hinblick auf das osteogene, chondrogene und adipogene Differenzierungspotential der Zellen angelegt. Nach 7-tägiger Stimulation mit 11,7 mW/cm2 zeigte sich die Osteocalcinexpression in jungen rMSCs signifikant erhöht. Bei alten rMSCs zeigte sich bei der gleichen Stimulationsdauer und Intensität eine um 40 % erniedrigte RUNX2-Expression, wohingegen eine 14-tägige Stimulation mit 44,5 mW/cm2 zu einer Erhöhung von RUNX2 führte. Bei einer FLIPUS-Applikation von 11,7 mW/cm2 zeigte sich sowohl nach 7 als auch nach 14 Tagen eine signifikant erhöhte Mineralisierung der Extrazellularmatrix von jungen rMSCs, wohingegen bei alten rMSCs kein Effekt zu beobachten war. Die Ergebnisse der Studie zeigen altersabhängige Unterschiede in den durch FLIPUS ausgelösten Effekten. Für die Zukunft und insbesondere für die klinische Anwendung wird es notwendig sein in weiterführenden Studien optimale Stimulationsparameter für unterschiedliche Altersgruppen zu definieren.
A positive effect of Low-Intensity Pulsed Ultrasound (LIPUS) on fracture healing was confirmed in previous studies. However the stimulation mechanisms and optimized stimulation parameters are still a matter of debate. In this study we analyzed the effects of stimulation period, intensity and donor-age on osteogenic differentiation of rat mesenchymal stromal cells (rMSCs). For isolation of rMSCs we used femur bones from 3-month (young) and 12-month (old) female Sprague Dawley rats. Cells from each donor were tested for their osteogenic, chondrogenic and adipogenic differentiation potentials, in order to confirm a pluripotent phenotype. After cultivation until passage 2, the cells were stimulated with focused LIPUS (FLIPUS) for 20 minutes per day with either 11.7 or 44.5 mW/cm2 acoustic intensity for 7 or 14 days. Each group had its own unstimulated control. We applied the following stimulation parameters: 3.6 MHz frequency, 27.8 % duty cycle, 100 Hz pulse repetition frequency. After stimulation osteogenic markers osteocalcin (OCN) and Runt-Related Transcription Factor 2 (RUNX2) were assessed by quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and degree of matrix calcification was analyzed by Alizarin Red S staining. After FLIPUS stimulation with acoustic intensity of 11.7 mW/cm2 OCN gene expression was significantly enhanced in young rMSCs on day 7, whereas old rMSCs showed a 40 % decrease in RUNX2 gene expression. However stimulation with 44.5 mW/cm2 resulted in increased expression of RUNX2 on day 14. FLIPUS treatment with 11.7 mW/cm2 for either 7 or 14 days enhanced extracellular matrix mineralization in young rMSCs, while old cells did not have any differences with unstimulated control. The results of this study demonstrated age-related differences in osteogenic response of rMSCs to FLIPUS stimulation. These findings emphasize necessity to optimize stimulation parameters, depending on donor age, for successful clinical administration.
