Pluripotency, where cells have the capacity to differentiate into all types of cells in the embryo, is a transient state in early embryonic development. Normally, it lasts for 2-3 days, but many animal species can undergo diapause to halt the development and retain pluripotency under unfavourable conditions. One way to induce the paused state is through inhibition of mechanistic target of rapamycin (mTOR). mTOR is a protein kinase that plays a central role in regulating cellular processes such as growth, metabolism, and autophagy with environmental inputs. Mouse embryos lacking mTOR failed to develop beyond the blastocyst stage. Overall, these indicate that mTOR plays a vital role in pluripotency regulation. However, the mechanisms remain unknown. In this study, I established and applied various biochemical, genetic and NGS technologies to investigate the role of nuclear mTOR in embryonic stem cells (mESCs). mTOR kinase activity was found to be essential for mESC differentiation and mTOR nuclear and chromatin localisation were observed. ChIP-seq experiments revealed that mTOR associates with the promoters of developmental genes at the chromatin in mESCs. In vitro kinase assay showed that mTOR is a histone H2A kinase, phosphorylating H2A at threonine 120 (H2AT120ph). Using integrative analyses of CUT&Tag and TT-SLAM-seq, I found that the level of H2AT120ph at mTOR-associated promoters and their nascent transcription transiently increases during pluripotency exit. These promoters had a high presence of polycomb repressive complex 1 (PRC1) and correlated with the polycomb histone marks, suggesting mTOR works closely with PRC to regulate gene expression. The results reveal a novel mechanism through which mTOR can regulate gene expression and may have implications in other developmental and disease contexts
Die Pluripotenz, bei der Zellen die Fähigkeit haben, sich in alle Zelltypen im Embryo zu differenzieren, ist ein vorübergehender Zustand in der frühembryonalen Entwicklung. Normalerweise dauert sie 2-3 Tage, aber viele Tierarten können eine Diapause durchlaufen, um die Entwicklung anzuhalten und die Pluripotenz unter ungünstigen Bedingungen aufrechtzuerhalten. Eine Möglichkeit, diesen pausierten Zustand herbeizuführen, ist die Hemmung des mechanistic target of rapamycin (mTOR). mTOR ist eine Proteinkinase, die eine zentrale Rolle bei der Regulation von zellulären Prozessen wie Wachstum, Stoffwechsel und Autophagie unter Einfluss von Umweltbedingungen spielt. Mäuseembryonen ohne mTOR entwickeln sich nicht über das Blastozystenstadium hinaus. Dies deutet insgesamt darauf hin, dass mTOR eine wichtige Rolle bei der Regulation der Pluripotenz spielt. Die genauen Mechanismen bleiben jedoch unbekannt. In dieser Studie habe ich verschiedene biochemische, genetische und NGS-Technologien etabliert und angewendet, um die Rolle von nukleärem mTOR in embryonalen Stammzellen (mESCs) zu untersuchen. Es stellte sich heraus, dass die Kinaseaktivität von mTOR für die Differenzierung von mESCs essentiell ist und mTOR eine nukleäre und chromatinale Lokalisation aufweist. ChIP-seq-Experimente ergaben, dass mTOR mit den Promotoren von Entwicklungs-Genen am Chromatin in mESCs assoziiert ist. In einem In-vitro-Kinase-Assay wurde festgestellt, dass mTOR eine Histone H2A-Kinase ist, die H2A am Threonin 120 phosphoryliert (H2AT120ph). Durch die Integration von CUT&Tag- und TT-SLAM-seq-Analysen konnte ich feststellen, dass der H2AT120ph-Spiegel an den mTOR-assoziierten Promotoren und ihrer neu synthetisierten Transkription während des Austritts aus der Pluripotenz vorübergehend ansteigt. Diese Promotoren wiesen eine hohe Präsenz des Polycomb-Repressive Complex 1 (PRC1) auf und korrelierten mit den Polycomb-Histonmarkierungen, was darauf hindeutet, dass mTOR eng mit PRC zusammenarbeitet, um die Genexpression zu regulieren. Die Ergebnisse enthüllen einen neuen Mechanismus, durch den mTOR die Genexpression regulieren kann, und könnten Auswirkungen auf andere Entwicklungs- und Krankheitszusammenhänge haben.
