Zona Pellucida Like Domain 1 Protein (ZPLD1) is a main component of the cupula, a gelatinous structure located in the labyrinth organ of the inner ear and involved in vestibular function. The N-glycosylated protein is likely able to organize high-molecular-weight polymers via its zona pellucida (ZP) module, which is common for many extracellular proteins that self-assemble into matrices. In this work, I confirmed that ZPLD1 can form multimers while setting up a cellular model leveraging Mardin-Darby canine kidney (MDCK) cells to study protein polymerization. I identified two motifs within ZPLD1 which regulate protein polymerization and follow previously published conserved regions, identified across ZP proteins. Mutational depletion of either one of these modules led to diminished or abnormal polymer formation outside of the cells, likely due to altered processing at the plasma membrane. Further, intracellular polymer formation was observed. Proteolytic cleavage during secretion, separating the regulatory motif located distinct of the ZP module from the mature monomer, seems to be necessary to enable proper polymerization. This separation requires a transmembrane domain as well as the consensus cleavage site, which were as well located and confirmed using the established model and corresponding ZPLD1 expression variants. I was in addition able to proof that a serine type protease, potentially membrane bound hepsin, executes protein maturation. While the molecular interactions of the identified motifs and the exact processing protease and mechanism remain to be proven, my findings suggest that ZPLD1 is a polymer forming ZP protein, following a well-orchestrated mechanism. This mechanism is likely shared by other homopolymerizing ZP family proteins, includes cleavage of a pro-peptide, conformational changes, and the formation of precursor protein dimers. Finally, the mechanism leads to building up the gelatinous hydrogel of the cupula, thereby being of high significance for proper vestibular function. Ultimately, the variety of pathologies with reported impact of altered ZPLD1 expression indicate potential further functionalities such as cell adhesion, migration or segregation adding significance of this protein as future research target.
Zona Pellucida Like Domain 1 Protein (ZPLD1) ist ein Hauptbestandteil der Cupula. Die Cupula ist eine gelartige Struktur, die sich im Labyrinth Organ des Innenohres befindet und für die räumliche Orientierung von entscheidender Bedeutung ist. Das N-glycosylierte Protein ist sehr wahrscheinlich in der Lage sich über sein Zona Pellucida (ZP) Modul zu komplexen, höhermolekularen Polymeren zusammenzuschließen. Diese ZP-Module sind typischer Bestandteil zahlreicher polymerbildender Proteine aus der Familie der ZP-Proteine. In der vorliegenden Arbeit konnte ich mithilfe eines zellulären Modells nachweisen, dass ZPLD1 Multimere bilden kann. Das Modell basiert auf stabil transfizierten Mardin-Darby-canine kidney (MDCK) Zellen, mit denen ich verschiedener ZPLD1 Varianten untersuchen und erste Erkenntnisse zu den zugrundeliegenden Mechanismen und Voraussetzungen gewinnen konnte. Dabei habe ich zwei hydrophobe Regionen identifiziert, die bei ZPLD1 wie auch anderen ZP-Proteinen eine wichtige regulatorische Funktion übernehmen. Deletion dieser Sequenzregionen führt zu abnormaler oder gar vollständig reduzierter Polymerbildung. Die beruht mutmaßlich auf einer fehlerhaften Prozessierung an der Zellmembran während des Sekretionsprozesses. Für diese Varianten konnten außerdem intrazelluläre Polymere beobachtet werden. Proteolytische Abspaltung während der Sekretion und die damit verbundene Trennung der regulatorischen Motive scheint unabdingbar für die korrekte Polymerbildung von ZPLD1 zu sein. Diese Spaltung bedarf zunächst einer Membranverankerung durch eine Transmembrandomäne sowie der Existenz einer Consensus Spaltstelle, die ich ebenfalls mittels oben genannter Methoden identifizieren und nachweisen konnte. Ich konnte zeigen, dass eine Serin-Protease für die Prozessierung von ZPLD1 verantwortlich ist. Obwohl der genaue Mechanismus und die exakte Protease noch identifiziert und beschrieben werden müssen, deuten meine Ergebnisse darauf hin, dass die Polymerbildung auf einem fein abgestimmten Mechanismus beruht. Dieser Mechanismus scheint dabei weitgehend identisch mit dem anderer Homopolymer bildender ZP-Proteine zu sein und bedarf der Spaltung des Pro-Peptides, Konformationsänderungen sowie die Bildung dimerer Vorläuferpolymere. Dieser Prozess ermöglicht die Ausbildung der Cupula und ist damit von entscheidender Bedeutung für die räumliche Orientierung. Veröffentlichte Transkriptom-Daten verschiedener Pathologien lassen überdies vermuten, dass ZPLD1 in Teilen wichtig für Prozesse wie Zell-Zell-Interaktion und -Adhesion, Zell-Migration oder die zellulären Segration während der Embryonalentwicklung sein könnte. Daher stellt ZPLD1 weiterhin ein spannendes Ziel für zukünftige Forschung dar.
