Focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) is a rare disease-causing glomerular lesion in the nephron and inadvertently end stage renal disease. Pathologically, FSGS is characterized by sclerosis in some (focal) parts of the glomeruli. Podocyte injury is the earliest morphological hallmark of FSGS supporting the notion that FSGS is a podocyte disease. The physiological function of podocytes is critically dependent on the proper intracellular calcium levels; excessive or deficient Calcium influx into these cells may result in foot process effacement, apoptosis, and nephron degeneration. A key protein involved in the regulation of Calcium influx is the transient receptor potential cation 6 (TRPC6), which is expressed in podocytes. Rare mutations in the TRPC6 gene were implicated to cause FSGS with high penetrance, presumably by increasing or decreasing calcium influx. Here I studied the effect of gain- and loss-of-function (GOF, LOF) mutations in TRCP6 on intracellular Calcium levels using novel model systems, including podocytes derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC). To establish an inducible human FSGS model system, I generated and phenotypically characterized three transgenic hiPSC lines with controllable overexpression of TRPC6 wild-type and FSGS-associated GOF and LOF mutations (P112Q and G757D). Furthermore, these cell lines were induced to differentiate into podocytes (iPodocytes). Initial experiments in HeLa and HEK293 reporter cell lines confirmed the impact of TRPC6 GOF and LOF mutants on Calcium influx. Although iPodocytes also showed Calcium responses consistent with GOF and LOF phenotypes, these were lower in comparison to data obtained from the reporter lines, probably due to reduced and aberrant expression of TRPC6 during podocyte differentiation. In addition, I reported a novel heterozygous TRPC6 mutation (V691Kfs*) in a large kindred with no signs of FSGS despite the presence of a largely truncated TRPC6 protein. Functional analysis showed that the V691Kfs* truncation inactivated the TRCP6 channel-specific Calcium influx consistent with a complete LOF phenotype. Our data corroborate that one defective dominant-negative TRPC6 gene copy and reduced Calcium influx through TRPC6 are not sufficient to cause FSGS. To increase our capacity to study the effect of mutations in rare disease models other than the kidney, I have established four new hiPSC lines derived from three different patients diagnosed with FSGS, Polycystic Kidney Disease (PKD), and Neurofibromatosis 13 Type 1 (NF1), as well as a healthy relative, respectively. These hiPSC lines can be differentiated into both 2D and 3D nephrogenic models and relevant tubule cell types (FSGS and PKD), or neural crest derivatives (NF1) using standard differentiation protocols to analyze disease-related phenotype and pathology. The newly established hiPSC – lines are available for research through the European Bank for iPSC (EBiSC).
Fokale segmentale Glomerulosklerose (FSGS) ist eine seltene Erkrankung, die zu glomerulären Läsionen im Nephron und unweigerlich zum Funktionsverlust der Niere führt. Pathologisch ist die FSGS durch Sklerose in einigen (fokalen) Bereichen der Glomeruli charakterisiert. Die Podozytenschädigung ist das früheste morphologische Merkmal der FSGS. Die physiologische Funktion der Podozyten hängt entscheidend von genauen intrazellulären Ca2+-Spiegeln ab; ein übermäßiger oder fehlender Ca2+-Einstrom in diese Zellen könnte zu einer Tilgung der Fußprozesse, Apoptose und Abbau des Nephrons führen. Ein an der Regulierung des Ca2+-Einstroms beteiligtes Protein ist das in Podozyten exprimierte Transient Receptor Potential Cation 6 (TRPC6). Seltene Mutationen im TRPC6-Gen werden mit der Entstehung von FSGS mit hoher Penetranz in Verbindung gebracht, vermutlich durch Erhöhung oder Verringerung des Kalziumeinstroms.Ich untersuchte den Einfluss von Gain- und Loss-of-Function (GOF, LOF) - Mutationen in TRCP6 auf den intrazellulären Ca2+-Spiegel mithilfe von neuartigen Modellsystemen, einschließlich aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) differenzierte Podozyten. Für die Etablierung des FSGS-Modellsystems wurden drei transgene hiPSC-Linien mit regulierbarer Überexpression von TRPC6-Wildtyp und FSGS-assoziierten GOF- und LOF-Mutationen (P112Q und G757D) erzeugt, charakterisiert und in Podozyten differenziert (iPodozyten). Anfängliche Experimente in HeLa- und HEK293-Reporterzelllinien bestätigten die Auswirkungen der TRPC6 GOF- und LOF-Mutanten auf den Ca2+-Einstrom. Obwohl auch in iPodozyten die mit den GOF- und LOF-Phänotyp übereinstimmenden Ca2+-Reaktionen gezeigt wurden, waren diese verglichen zu den Daten aus den Reporterlinien geringer, was vermutlich an einer reduzierten und abweichenden Expression von transgenem TRPC6 während der Differenzierung lag. Zusätzlich wurde eine neuartige heterozygote TRPC6-Mutation (V691Kfs*) in einer Kohorte, die trotz eines weitgehend verkürzten TRPC6-Proteins keine Anzeichen von FSGS zeigte, generiert. Die funktionelle Analyse zeigte, dass die V691Kfs*-Trunkierung den TRPC6-spezifischen Ca2+-Einstrom inaktiviert, was einem vollständigen LOF-Phänotyp gleicht. Unsere Daten bestätigen, dass eine defekte dominant-negative TRPC6-Genkopie und ein verminderter Ca2+-Einstrom durch TRPC6 nicht ausreichen um eine FSGS auszulösen. 15 Um die Auswirkungen von Mutationen in Modellen für weitere seltene Krankheiten besser untersuchen zu können, wurden vier neue hiPSC-Linien etabliert, die von drei verschiedenen Patienten mit FSGS, polyzystischer Nierenerkrankung (PKD) und Neurofibromatose Typ 1 (NF1), sowie von einem gesunden Verwandten stammen. Diese Zelllinien können mithilfe von Standardprotokollen in 2D- und 3D-Nephronmodelle und Tubuluszelltypen (FSGS und PKD) oder Neuralleisten-Derivate (NF1) für eine Analyse des Krankheitsbilds und der Pathologie differenziert werden und stehen für Forscher über die Europäische Bank für iPSC (EBiSC) zur Verfügung.
