dc.contributor.author
Wilkening, Ulrich
dc.date.accessioned
2018-06-07T17:42:03Z
dc.date.available
2009-05-15T06:09:45.896Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/4161
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-8361
dc.description.abstract
Die Skelettentwicklung unterliegt komplexen regulatorischen Mechanismen und
viele Krankheiten sind mit Mutationen in den Genen, die zu diesem Prozess
beitragen, assoziiert. Bis heute ist das gesamte Netzwerk an Faktoren, die in
diese Vorgänge involviert sind, noch nicht vollständig aufgeklärt. Deswegen
lag der Fokus dieser Arbeit auf der Identifikation von neuen Genen mit einer
relevanten Funktion für die Skelettentwicklung. Die Expression des
Transkriptionsfaktors Mef2c war in embryonalen Humeri von Runx2-/- Mäusen
reduziert [Hecht et al., 2007]. Expressionsanalysen zeigten mRNA Transkript
von Mef2c im Perichondrium, den prähypertrophen und hypertrophen Chondrozyten
von Humeri zum embryonalen Stadium E15,5. Dies ließ eine Rolle von Mef2c in
der Skelettentwicklung vermuten. Funktionelle Untersuchungen in vitro in
mesenchymalen Hühnerzellen, die eine osteoblastische Differenzierung
durchliefen und in Hühner Micromass Kulturen zeiten, daß eine retrovirale
Überexpression von Mef2c die Transkriptmenge der Differenzierungsmarker
Col10a1, Ibsp, Akp2, Ihh und Pthr1 erhöhte. Die Cre/lox vermittelte Deletion
von Mef2c im Gliedmaßenmesenchym und in Chondrozyten führte zu einem
kurzgliedrigen Phänotyp mit einer Verzögerung der hypertrophen Differenzierung
und enchondralen Ossifikation. Histologische Untersuchungen der mutanten
Knochen zeigten eine signifikante Verbreiterung und gestörte Orientierung der
Wachstumsfugen plus eine auffällige Verdickung des kortikalen Knochens. Diese
Merkmale ähnelten denen bei metaphysären Chondrodysplasien des Menschen –
speziell vom Typ Jansen (JMC). Dies implizierte eine Fehlregulation der
Ihh/PTHrP Signalschleife, da eine Hyperaktivierung des PTH/PTHrP-Rezeptors bei
der JMC nachgewiesen wurde. Zusätzlich erschienen in den Knochen der
Mef2cloxP/KO Mäuse die Expressionsmuster von Col10a1, Ihh, Pthr1 und Runx2
gestört und in ihrer Stärke reduziert. Die Analyse regulatorischer Regionen in
den Promotoren der Gene, die durch eine in vitro Überexpression von Mef2c
stimuliert wurden, enthüllte mögliche Mef2c Konsensussequenzen in den
Promotoren von Col10a1, Ihh, Ocn und Pthr1. In Reporterassays war Mef2c der
stärkste Aktivator von Col10a1 Reporterkonstrukten, während Pthr1
Reporterkonstrukte synergistisch durch Mef2c, Runx2 und Sp1 aktiviert wurden.
Im Gegensatz dazu zeigte Mef2c einen inhibitorischen Effekt auf die Runx2
vermittelte Aktivierung eines Ocn Reporters. PTH/PTHrP Signale sind bekannte
Inhibitoren für die Expression von Col10a1 – in dieser Arbeit konnte gezeigt
werden, daß sie auch die p38 abhängige Phosphorylierung von Mef2c in
Chondrozyten reduzierten. Mutationen unterschiedlicher Posphorylierungsstellen
im Mef2c konnten jedoch die Regulation des Col10a1 Promotors durch PTHrP und
p38 nicht aufheben. Interessanterweise führte ein Verlust der p38 und Erk5
spezifischen Phosphorylierungsstelle an Position S387 zu einer erhöhten
Aktivierbarkeit des Mef2c durch p38. Damit wird die p38 abhängige
Phosphorylierung von Mef2c durch PTHrP reguliert, aber sie übt nur eine
modulierende Rolle aus. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit,
daß Mef2c eine wichtige Rolle in der enchondralen Ossifikation spielt und
erlauben eine Positionierung von Mef2c innerhalb der Ihh/PTHrP Signalschleife
mit einer potentiellen Rolle bei der Regulation der Runx2 Expression und
Funktion.
de
dc.description.abstract
Skeletal development is subject to complex regulatory mechanisms and many
diseases are associated with mutations in genes that contribute to this
process. Since the network of factors involved in this process has not been
entirely elucidated yet, this work focused on the identification of new genes
with a role in skeletal development. The expression of the transcription
factor Mef2c was discovered to be downregulated in embryonic humeri of
Runx2-/- mice [Hecht et al., 2007]. Expression analysis revealed an expression
pattern of Mef2c in the perichondrium, prehypertrophic and hypertrophic
chondrocytes of E15,5 humeri suggesting a role in the skeletal development.
Functional analysis in vitro in chicken mesenchymal cells undergoing
osteoblastic differentiation and chicken micromass cultures showed that
retroviral overexpression of Mef2c could upregulate the transcript levels of
the differentiation markers Col10a1, Ibsp, Akp2, Ihh and Pthr1. Cre/lox
mediated deletion of Mef2c in the limb mesenchyme or in chondrocytes resulted
in a short-limbed phenotype with a delay in hypertrophic differentiation and
endochondral ossification. Histological analysis of the mutant bones revealed
a significant broadening and disturbed orientation of the growth plates plus a
significant thickening of the cortical bone. These characteristics resembled
the human metaphyseal chondrodysplasias, especially the type Jansen (JMC).
This implied a dysfunction of the Ihh/PTHrP regulatory loop since the
PTH/PTHrP receptor was found to be hyperactivated in JMC. Furthermore in the
Mef2cloxP/KO bones the expression patterns of Col10a1, Ihh, Pthr1 and Runx2
appeared to be disorganised and reduced in strength. Analysis of the
regulatory regions of genes that were stimulated in vitro by overexpression of
Mef2c revealed putative MEF2 binding sites in the promoters of Col10a1, Ihh,
Ocn and Pthr1. In reporter-assays Mef2c showed the strongest activating effect
on Col10a1 reporter construct whereas Pthr1 reporter constructs were
synergistically activated by Mef2c, Runx2 and Sp1. In contrast, Mef2c exerted
inhibitory effects on the Runx2-mediated activation of a Ocn reporter.
PTH/PTHrP signaling is known to inhibit Col10a1 expression and was found to
reduce p38 dependent phosphorylation of Mef2c in chondrocytes. However
mutations of known phosphorylation sites in the Mef2c protein were not able to
abolish the regulation of the Col10a1 promoter by PTHrP and p38. Interestingly
a loss of the p38 and Erk5 specific phosphorylation site at position S387
resulted in a higher response of Mef2c to p38 activation. Thus, the
p38-dependent phosphorylation of Mef2c is regulated by PTHrP, but only has a
modulatory role. Taken together the results show an important role of Mef2c
during endochondral ossification and position Mef2c within the Ihh/PTHrP
signaling loop with a potential role of regulating Runx2 expression and
function.
en
dc.format.extent
[3], VII, 137 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Skelettentwicklung
dc.subject
enchondrale Ossifikation
dc.subject
Hypertrophe Differenzierung
dc.subject
konditionelles Mausmodell
dc.subject
skeletal development
dc.subject
endochondral ossification
dc.subject
hypertrophic differentiation
dc.subject
conditional mouse model
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::576 Genetik und Evolution
dc.title
Funktionelle Analyse von in der Skelettentwicklung differentiell regulierten
Genen
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Stefan Mundlos
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Wolfgang Schuster
dc.date.accepted
2009-05-11
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000010056-3
dc.title.translated
Functional analysis of genes differentially regulated during skeletal
development
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000010056
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000005627
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access