Die Skelettentwicklung unterliegt komplexen regulatorischen Mechanismen und viele Krankheiten sind mit Mutationen in den Genen, die zu diesem Prozess beitragen, assoziiert. Bis heute ist das gesamte Netzwerk an Faktoren, die in diese Vorgänge involviert sind, noch nicht vollständig aufgeklärt. Deswegen lag der Fokus dieser Arbeit auf der Identifikation von neuen Genen mit einer relevanten Funktion für die Skelettentwicklung. Die Expression des Transkriptionsfaktors Mef2c war in embryonalen Humeri von Runx2-/- Mäusen reduziert [Hecht et al., 2007]. Expressionsanalysen zeigten mRNA Transkript von Mef2c im Perichondrium, den prähypertrophen und hypertrophen Chondrozyten von Humeri zum embryonalen Stadium E15,5. Dies ließ eine Rolle von Mef2c in der Skelettentwicklung vermuten. Funktionelle Untersuchungen in vitro in mesenchymalen Hühnerzellen, die eine osteoblastische Differenzierung durchliefen und in Hühner Micromass Kulturen zeiten, daß eine retrovirale Überexpression von Mef2c die Transkriptmenge der Differenzierungsmarker Col10a1, Ibsp, Akp2, Ihh und Pthr1 erhöhte. Die Cre/lox vermittelte Deletion von Mef2c im Gliedmaßenmesenchym und in Chondrozyten führte zu einem kurzgliedrigen Phänotyp mit einer Verzögerung der hypertrophen Differenzierung und enchondralen Ossifikation. Histologische Untersuchungen der mutanten Knochen zeigten eine signifikante Verbreiterung und gestörte Orientierung der Wachstumsfugen plus eine auffällige Verdickung des kortikalen Knochens. Diese Merkmale ähnelten denen bei metaphysären Chondrodysplasien des Menschen – speziell vom Typ Jansen (JMC). Dies implizierte eine Fehlregulation der Ihh/PTHrP Signalschleife, da eine Hyperaktivierung des PTH/PTHrP-Rezeptors bei der JMC nachgewiesen wurde. Zusätzlich erschienen in den Knochen der Mef2cloxP/KO Mäuse die Expressionsmuster von Col10a1, Ihh, Pthr1 und Runx2 gestört und in ihrer Stärke reduziert. Die Analyse regulatorischer Regionen in den Promotoren der Gene, die durch eine in vitro Überexpression von Mef2c stimuliert wurden, enthüllte mögliche Mef2c Konsensussequenzen in den Promotoren von Col10a1, Ihh, Ocn und Pthr1. In Reporterassays war Mef2c der stärkste Aktivator von Col10a1 Reporterkonstrukten, während Pthr1 Reporterkonstrukte synergistisch durch Mef2c, Runx2 und Sp1 aktiviert wurden. Im Gegensatz dazu zeigte Mef2c einen inhibitorischen Effekt auf die Runx2 vermittelte Aktivierung eines Ocn Reporters. PTH/PTHrP Signale sind bekannte Inhibitoren für die Expression von Col10a1 – in dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß sie auch die p38 abhängige Phosphorylierung von Mef2c in Chondrozyten reduzierten. Mutationen unterschiedlicher Posphorylierungsstellen im Mef2c konnten jedoch die Regulation des Col10a1 Promotors durch PTHrP und p38 nicht aufheben. Interessanterweise führte ein Verlust der p38 und Erk5 spezifischen Phosphorylierungsstelle an Position S387 zu einer erhöhten Aktivierbarkeit des Mef2c durch p38. Damit wird die p38 abhängige Phosphorylierung von Mef2c durch PTHrP reguliert, aber sie übt nur eine modulierende Rolle aus. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, daß Mef2c eine wichtige Rolle in der enchondralen Ossifikation spielt und erlauben eine Positionierung von Mef2c innerhalb der Ihh/PTHrP Signalschleife mit einer potentiellen Rolle bei der Regulation der Runx2 Expression und Funktion.
Skeletal development is subject to complex regulatory mechanisms and many diseases are associated with mutations in genes that contribute to this process. Since the network of factors involved in this process has not been entirely elucidated yet, this work focused on the identification of new genes with a role in skeletal development. The expression of the transcription factor Mef2c was discovered to be downregulated in embryonic humeri of Runx2-/- mice [Hecht et al., 2007]. Expression analysis revealed an expression pattern of Mef2c in the perichondrium, prehypertrophic and hypertrophic chondrocytes of E15,5 humeri suggesting a role in the skeletal development. Functional analysis in vitro in chicken mesenchymal cells undergoing osteoblastic differentiation and chicken micromass cultures showed that retroviral overexpression of Mef2c could upregulate the transcript levels of the differentiation markers Col10a1, Ibsp, Akp2, Ihh and Pthr1. Cre/lox mediated deletion of Mef2c in the limb mesenchyme or in chondrocytes resulted in a short-limbed phenotype with a delay in hypertrophic differentiation and endochondral ossification. Histological analysis of the mutant bones revealed a significant broadening and disturbed orientation of the growth plates plus a significant thickening of the cortical bone. These characteristics resembled the human metaphyseal chondrodysplasias, especially the type Jansen (JMC). This implied a dysfunction of the Ihh/PTHrP regulatory loop since the PTH/PTHrP receptor was found to be hyperactivated in JMC. Furthermore in the Mef2cloxP/KO bones the expression patterns of Col10a1, Ihh, Pthr1 and Runx2 appeared to be disorganised and reduced in strength. Analysis of the regulatory regions of genes that were stimulated in vitro by overexpression of Mef2c revealed putative MEF2 binding sites in the promoters of Col10a1, Ihh, Ocn and Pthr1. In reporter-assays Mef2c showed the strongest activating effect on Col10a1 reporter construct whereas Pthr1 reporter constructs were synergistically activated by Mef2c, Runx2 and Sp1. In contrast, Mef2c exerted inhibitory effects on the Runx2-mediated activation of a Ocn reporter. PTH/PTHrP signaling is known to inhibit Col10a1 expression and was found to reduce p38 dependent phosphorylation of Mef2c in chondrocytes. However mutations of known phosphorylation sites in the Mef2c protein were not able to abolish the regulation of the Col10a1 promoter by PTHrP and p38. Interestingly a loss of the p38 and Erk5 specific phosphorylation site at position S387 resulted in a higher response of Mef2c to p38 activation. Thus, the p38-dependent phosphorylation of Mef2c is regulated by PTHrP, but only has a modulatory role. Taken together the results show an important role of Mef2c during endochondral ossification and position Mef2c within the Ihh/PTHrP signaling loop with a potential role of regulating Runx2 expression and function.
