Neuronal branching and synaptogenesis are developmental processes that ensure the complex yet precise connectivity of billions of neurons in the brain. These processes rely on the integration of cell extrinsic and intrinsic factors that determine growth. Phospholipid-phosphatase related protein 3 (PLPPR3) belongs to a family of transmembrane proteins, which are highly expressed in neuronal development and regulate critical growth processes in neurons. Prior work in the lab established a crucial function of PLPPR3 in controlling axon branching through the induction of axonal filopodia. However, at the start of this PhD project, little information was available regarding the signaling events regulating PLPPR3 function. The work presented here establishes PLPPR3 as a highly phosphorylated protein with unique signaling integration property during neuronal development. I identify 26 high-confidence phosphorylation sites in the intracellular domain of PLPPR3 using mass spectrometry. My experiments show that the phosphorylation state of PLPPR3 is dependent on its proximity to the plasma membrane, as half of these phosphorylation events occur only in a membrane-attached variant of the PLPPR3 intracellular domain (chapter 2). I identify PLPPR3 S351 as a bona fide phosphorylation site of protein kinase A (PKA), and provide evidence that the intracellular domain is also a substrate for protein kinase C (PKC) and glycogen synthase kinase 3 (GSK3) (chapter 3). I generated a phospho-specific antibody for PLPPR3 S351 and validated its use in western blot experiments (chapter 4). Phosphorylation levels of S351 mimic the developmentally-regulated expression of PLPPR3, however, my experiments suggest that this phosphorylation event does not regulate filopodia formation, the well-described function of PLPPR3 during early development. Instead, phosphorylation at S351 modulates binding to BASP1, a growth-associated protein implicated in axonal development and regeneration. Characterization of PLPPR3 and BASP1 co-localization indicates their distinct enrichment in presynaptic compartments (chapter 5). Furthermore, this work includes validation data of six BASP1 antibodies (Appendix, chapter 6). Finally, I provide theoretical framework of PLPPR3 phosphorylation-based signal integration, and working models of PLPPR3-BASP1 based synapse formation (chapter 7). In summary, this doctoral thesis identified phosphorylation events in the intracellular domain of PLPPR3, uncovered a specific PKA-dependent signaling event at S351, and a novel interaction partner of PLPPR3 at neuronal synapses. Taken together, these data expand our knowledge of PLPPR3 in neuronal development.
Neuronale Verzweigung und Synaptogenese sind Entwicklungsprozesse, die die komplexe und dennoch präzise Konnektivität von Milliarden von Neuronen im Gehirn sicherstellen. Diese Entwicklungsprozesse beruhen auf der Integration zellextrinsischer und intrinsischer Faktoren, die das Wachstum bestimmen. Das Phospholipid-Phosphatase-verwandte Protein 3 (PLPPR3) gehört zu einer Familie von Transmembranproteinen, die in der neuronalen Entwicklung stark exprimiert werden und kritische Wachstumsprozesse in Neuronen regulieren. Frühere Arbeiten im Labor haben eine entscheidende Funktion von PLPPR3 bei der Steuerung der Axonverzweigung durch die Induktion axonaler Filopodien nachgewiesen. Zu Beginn dieses Doktoratsprojekts waren jedoch nur wenige Informationen über die Signalmechanismen verfügbar, die die PLPPR3-Funktion regulieren. Die hier vorgestellte Arbeit etabliert PLPPR3 als hoch phosphoryliertes Protein und schlägt es als Signalintegrator vor. Ich identifiziere mithilfe der Massenspektrometrie 26 hochzuverlässige Phosphorylierungsstellen in der intrazellulären Domäne von PLPPR3. Meine Experimente zeigen, dass der Phosphorylierungszustand von PLPPR3 von seiner Nähe zur Plasmamembran abhängt, da die Hälfte dieser Phosphorylierungsereignisse nur in der membrangebundenen intrazellulären Domäne vorhanden ist (Kapitel 2). Ich identifiziere PLPPR3 S351 als eine Phosphorylierungsstelle der Proteinkinase A (PKA) und liefere den Beweis, dass die intrazelluläre Domäne auch ein Substrat für Proteinkinase C (PKC) und Glykogensynthasekinase 3 (GSK3) ist (Kapitel 3). Ich habe einen phosphospezifischen Antikörper für PLPPR3 S351 generiert und seine Verwendung in western blot Experimenten validiert (Kapitel 4). Die Phosphorylierungsniveaus von S351 ahmen die entwicklungsregulierte Expression von PLPPR3 nach. Meine Experimente legen jedoch nahe, dass dieses Phosphorylierungsereignis nicht die Bildung von Filopodien reguliert, die gut beschriebene Funktion von PLPPR3 während der frühen Entwicklung. Stattdessen moduliert die Phosphorylierung an S351 die Bindung an BASP1, ein wachstumsassoziiertes Protein, das an der Entwicklung und Regeneration von Axonen beteiligt ist. Die Charakterisierung der Co-Lokalisierung von PLPPR3 und BASP1 zeigt deren deutliche Anreicherung in präsynaptischen Kompartimenten (Kapitel 5). Darüber hinaus umfasst diese Arbeit Validierungsdaten von sechs BASP1-Antikörpern (Anhang, Kapitel 6). Abschließend stelle ich einen theoretischen Rahmen für die auf PLPPR3-Phosphorylierung basierende Signalintegration und Arbeitsmodelle für die auf PLPPR3-BASP1 basierende Synapsenbildung bereit (Kapitel 7). Zusammenfassend identifiziert diese Doktorarbeit Phosphorylierungsereignisse in der intrazellulären Domäne von PLPPR3, deckt ein spezifisches PKA-abhängiges Signalereignis bei S351 und einen neuen Interaktionspartner von PLPPR3 an neuronalen Synapsen auf. Zusammengenommen erweitern diese Daten unser Wissen über PLPPR3 in der neuronalen Entwicklung.
