Staphylococcus aureus is a widespread Gram-positive bacterium that colonizes up to 80% of the human population as a facultative pathogen. It can cause a variety of diseases, ranging from mild skin infections to life-threatening endocarditis, pneumonia, and sepsis. S. aureus is particularly notorious for its ability to develop resistances against antimicrobial agents, a process that dates back to the discovery of penicillin. Today, methicillin-resistant S. aureus presents one of the greatest burdens to our healthcare system. The development of new treatments is therefore of the utmost urgency, especially that of an effective vaccine. So far, however, all promising candidates have failed as soon as they reached the clinical phase. One of the main reasons for this is the species-specificity of S. aureus, which is equipped with several virulence factors that are adapted to the human immune system. A promising new method for bridging this translational gap are humanized mice. These are immunodeficient mouse strains engrafted with human stem cells, leading to the development of a viable human immune system. One of the most commonly used strains is the NSG mouse, which was also chosen in the S. aureus infection studies conducted so far. These encompass only a small number of models, including peritonitis, skin infection, pneumonia, and osteomyelitis. Humanized NSG (huNSG) mice were more susceptible to the pathogen than the control groups in all of these models. For this thesis, 6 to 8 week old NSG mice were engrafted with cord-blood derived human stem cells and infected after 18 weeks with S. aureus in a localized, deep-tissue abscess model. The huNSG mice and the control groups, wild-type mice (Balb/c), murinized NSG mice (mice implanted with murine bone marrow cells), and non-engrafted NSG mice were weighed every day and their general condition was checked. In addition, the bioluminescence signal in the infected muscle was measured daily. The animals were randomly removed from the experiment after two or seven days, to cover both the acute and the chronic stages of the infection. The huNSG mice consistently showed stronger bioluminescence signals and a higher bacterial burden in the muscle could be detected on day 7. The difference in survival between the groups was particularly striking. All control animals (except one non-engrafted NSG mouse) assigned to the day-7 group survived until the end of the experiment. In contrast, 7 of 20 huNSG animals reached the humane endpoint before. In huNSG mice, the bacteria spread to significantly more inner organs than in the wild-type and the murinized mice, where they also reached a higher bacterial count. Importantly, a direct correlation between the survival probability and the degree of humanization could be determined. HuNSG mice had significantly higher human and murine cytokine levels in the blood and the muscle than the control groups. The dynamics between the human and murine cytokines also varied greatly. While the levels of murine cytokines remained mostly constant, their human counterparts decreased significantly between day 2 and day 7. The number of human B cells also decreased noticeably in the bone marrow, the same being true for monocytes in the blood and bone marrow. In contrast, murine monocytes increased significantly. Humanized NSG mice sustain only very small numbers of human neutrophil cells, which play an important role in the human immune defence against S. aureus. Consequently, humanized NSG-SGM3 (huSGM3) animals were used for the second trial, as this mouse strain is equipped with three human cytokines that support the formation of myeloid cell lineages. However, overexpression of these cytokines also leads to undesirable side effects in these mice. The animals become anaemic during long-term humanization and eventually die. For this reason, the huSGM3 mice entered the experiments 12 weeks post engraftment. At this time, the animals showed a robust degree of humanization and only slightly decreased erythrocyte and haemoglobin levels. The humanized SGM3 mice were significantly more sensitive in the muscle abscess model than the control groups, including the HuNSG mice. The mice reached the humane endpoint earlier and in such large numbers, that not enough animals were available for the day 7 group. No differences could be detected with respect to the bacterial load in muscle and internal organs that would have explained the death of the animals. In addition, the number of murine immune cells available did not vary between the two humanized groups. In contrast, the huSGM3 mice had significantly more human cells in the blood and spleen; these included B cells, T cells, monocytes, and neutrophils. Individual cytokine levels, namely hCCL-2, hIL-8, hIL-6, and hTNF-α, were also significantly increased in the humanized SGM3 mice. Similar to the first trial, a direct correlation between the degree of humanization and a severe progression of the infection could be found. Further experiments are needed to fully understand the interactions between the bacterium and the human immune system in the humanized mice. It will be particularly important to characterize the role of virulence factors, such as the Panton-Valentin-Leukocidin, which are characterized by their affinity to human cells. Nevertheless, the results obtained in this thesis represent important new gains in knowledge, which may contribute to the development of an effective vaccine against S. aureus.
Staphyloccous aureus ist ein weitverbreitetes, Gram-positives Bakterium, das als fakultativ pathogener Erreger bis zu 80% der Bevölkerung kolonisiert. Dieses Pathogen kann eine Reihe von Krankheiten verursachen, die von einfachen Hautinfektionen bis hin zu lebensgefährlichen Infektionen wie Endokarditis, Pneumonie und Septikämie reichen. Besonders berüchtigt ist S. aureus für seine Fähigkeit Resistenzen gegen antimikrobielle Wirkstoffe zu entwickeln. Ein Prozess, der schon mit der Entdeckung des Penicillins begann. Heute stellen Methicillin- resistente S. aureus eine der größten Belastungen für unsere Gesundheitssysteme dar. Die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden ist deshalb von großer Dringlichkeit. Dies gilt insbesondere für die Entwicklung eines effektiven Impfstoffes. Bisher sind allerdings alle vielversprechenden Ansätze gescheitert, sobald sie die klinische Phase erreichten. Einer der Hauptgründe hierfür ist die Speziesspezifität einer Reihe von Virulenzfaktoren von S. aureus, die humane Immunzellen deutlich stärker schädigen als die gleichen Zelltypen der Maus. Eine vielversprechende neue Methode, um die translationale Lücke zwischen Maus und Mensch zu überbrücken, sind humanisierte Mäuse. Hierbei handelt es sich um immundefiziente Mauslinien, denen humanen Stammzellen implantiert werden, aus denen sich in der Folge ein humanes Immunsystem entwickelt. Eine der hierfür am häufigsten verwendeten Mauslinien ist die sogenannte NSG-Maus, diese wurde auch in den bisher durchgeführten Infektionsversuchen mit S. aureus verwendet. In Peritonitis-, Haut-, Pneumonie- und Osteomyelitis-Modellen erwiesen sich humanisierte NSG (huNSG) Tiere deutlich empfindlicher als die Kontrollgruppen. In dieser Dissertation wurde zunächst 6 bis 8 Wochen alten NSG-Mäusen aus Nabelschnurblut isolierte humane Stammzellen injiziert. Die Mäuse wurden anschließend nach 18 Wochen mit S. aureus in einem lokalen Abszessmodell infiziert. Die huNSG-Mäuse und die Kontrollgruppen [= Wildtyp-Mäuse (Balb/c), murinisierte NSG- Mäuse (mit murinen Knochenmarkszellen implantierte Mäuse) und unbehandelte NSG- Mäuse] wurden jeden Tag gewogen und ihr Allgemeinbefinden überprüft. Zudem wurde täglich das Biolumineszenz-Signal im infizierten Muskel gemessen. Die Tiere wurden entweder nach zwei oder sieben Tagen aus dem Experiment genommen, damit sowohl die akute als auch die chronische Phase der Infektion beurteilt werden konnte. Die huNSG-Mäuse zeigten durchgehend ein höheres Biolumineszenz-Signal und am Tag 7 konnte auch eine höhere Keimbelastung des Muskels festgestellt werden. Besonders auffällig war aber die unterschiedliche Überlebensrate zwischen den Gruppen. Alle Kontrolltiere (außer einer unbehandelten NSG-Maus) die der Tag-7 Gruppe zugeordnet waren, haben bis zum Experimentende überlebt. Dagegen erreichten sieben von 20 huNSG-Tieren den humanen Endpunkt zu früheren Zeitpunkten. In den humanisierten NSG-Mäusen zeigte sich eine deutlich stärkere Streuung der Bakterien in die inneren Organe als bei den Wildtyp-Mäusen und den murinisierten Mäusen. Es konnte zudem ein direkter Zusammenhang zwischen der Überlebenswahrscheinlichkeit und dem Grad der Humanisierung festgestellt werden. HuNSG- Mäuse zeigten deutlich höhere humane und murine Zytokin-Mengen im Blut und im Muskel als die Kontrollgruppen. Auch die Dynamik zwischen den humanen und murinen Zytokinen variierte stark. Während die Werte der murinen Zytokine größtenteils konstant blieben, sanken die humanen Zytokine zwischen Tag 2 und Tag 7 deutlich ab. Auch die Zahl der humanen B- Zellen nahm im Knochenmark stark ab, gleiches galt für die Monozyten im Blut und dem Knochenmark. Die murinen Monozyten nahmen im Gegensatz dazu sichtlich zu. Da humanisierte NSG-Mäuse nur sehr geringe Mengen an humanen Neutrophilen bilden, diese jedoch im Menschen eine wichtige Rolle im Kampf gegen S. aureus spielen, verwendeten wir in einer zweiten Versuchsreihe humanisierte NSG-SGM3 (huSGM3) Mäuse. Diese Mauslinie ist mit drei humanen Zytokinen ausgestattet, die die Ausbildung myeloider Zelllinien unterstützen. Allerdings führt die Überexpression dieser Zytokine auch zu unerwünschten Nebenwirkungen bei diesen Mäusen. Die Tiere werden im Laufe der Humanisierung immer anämischer und versterben schlussendlich. Aus diesem Grund wurden die SGM3-Mäuse bereits 12 Wochen nach der Humanisierung für die Infektionsversuche verwendet. Zu diesem Zeitpunkt zeigten die Tiere einen robusten Humanisierungsgrad und nur geringfügig erniedrigte Erythrozytenzahlen und Hämoglobinwerte. Die HuSGM3-Mäuse zeigten sich im Muskelabszessmodell deutlich empfindlicher als die Kontrollgruppen, inklusive den HuNSG- Mäusen. Die Tiere erreichten den humanen Endpunkt früher als die HuNSG-Mäuse, so dass nicht ausreichende Tierzahlen für die Tag 7-Gruppe zur Verfügung standen und dieser Zeitraum somit nicht untersucht werden konnte. Bezüglich der bakteriellen Last im Muskel und in den inneren Organen konnten keine Unterschiede zwischen den HuNSG- und den HuSGM3-Mäusen festgestellt werden, die das Versterben der Tiere erklären könnten. Auch die Anzahl der murinen Immunzellen variierte nicht zwischen den beiden humanisierten Gruppen. Dagegen zeigten sich deutlich mehr humane Immunzellen (B-Zellen, T-Zellen, Monozyten und Neutrophile) im Blut und in der Milz der huSGM3-Mäuse. Auch einzelne Zytokine, nämlich hCCL-2, hIL-8, hIL-6 und hTNF-α, waren in den humanisierten SGM3- Mäusen signifikant erhöht. Weiterhin konnte, ähnlich wie im ersten Versuchsteil, ein direkter Zusammenhang zwischen dem Humanisierungsgrad und dem Schweregrad des Infektionsverlauf festgestellt werden. Es werden noch viele weiterführende Experimente nötig sein, um die Wechselwirkungen zwischen dem Bakterium und den menschlichen Immunsystem in den humanisierten Mäusen genau zu verstehen. So bleibt die wichtige Frage ungeklärt, welchen Einfluss Virulenzfaktoren, die eine ausgeprägte Affinität humanen Zellen gegenüber zeigen, wie zum Beispiel das Panton-Valentin-Leukozidin, auf den Infektionsverlauf haben. Dennoch stellen die Ergebnisse dieser Dissertation wichtige neue Erkenntnisse dar, die bei der Entwicklung einer funktionierenden Vakzine gegen S. aureus genutzt werden können.
