Simulation of enzyme reactions: The influence of protonation on catalysis and on protein-protein association

Abstract

# Abstract

In this work the role of electrostatic interactions in proteins for different processes were investigated. The main subject was to study the influence of electrostatic interactions on catalysis and protein-protein association.

The protonation pattern of the enzyme acetylcholinesterase was determined by a Monte-Carlo titration method on the basis of the electrostatic potentials at the titratable groups. The calculated protonation pattern showed that not all titratable groups are in their standard protonation state. This finding suggested that the function of acetylcholinesterase has to be judged not only on its structure and the standard charge distribution, where generally titratable groups are assumed to be charged, but also on the carefully established protonation pattern. In acetylcholinesterase, especially the residue Glu199, which is near to the active site and highly conserved among different species, gave rise to several discussions, because the Gln199Ala mutation did not show as large effects on the reaction kinetics as one could expect when a charged group is replaced by alanine. My titration calculations showed that in fact Glu199 is not charged but protonated in the free as well as in the acylated enzyme. This explains very well the small effect in the mutation experiment.

The next question was, if the uncharged protonation state of Glu199 is consistent with the catalytic mechanism of acetylcholinesterase. I investigated the rate determining deacylation step of acetylcholinesterase. This simulation study was done within the framework of the empirical valence bond method (EVB). With this method the free energy along the reaction path can be calculated. The unique parameterization facilities of the EVB method allow a meaningful comparison of the calculated free energies with experimental values, which are deducible from the measured reaction rates. In my study, I could reproduce the experimental reaction rate of the deacylation with a sufficiently small deviation: The rate obtained by the simulation studies was only by a factor of 30 smaller than the experimental rate. This result could only be obtained with acetylcholinesterase in the appropriate protonation state. As a confirmation of the previous Monte-Carlo titration study I found, that Glu199 in the charged titration state decreased the rate by the factor 10^4. This finding underlines the importance to consider the correct protonation pattern for theoretical investigations on enzyme functions.

Moreover, the study on acetylcholinesterase revealed that the protonation pattern in the active site is in agreement with the general assumed mechanism of serine hydrolases, where the histidine of the catalytic triad forms a hydrogen bond with the Asp or Glu residue of the catalytic triad, that is negatively charged. In my study the proton at His440 was found on the right nitrogen atom to form this hydrogen bond and Glu327 was found to be negatively charged.

The trajectory of the simulated reaction showed, that the tetrahedral intermediate of the deacylation step is stabilized by an oxyanion hole as is also known for the acylation step.

I found in my calculations, that the presence or absence of choline, the reaction product of the initial acylation reaction, effects neither the protonation pattern of the enzyme nor the energetics of the catalyzed reaction. Hence, choline might still be in the binding pocket during deacylation. This is somehow surprising, as choline is positively charged and should therefore have an influence on the active site properties. This indifferent finding suggests, that choline may leave the binding pocket also after the deacylation step in contrast of what is generally assumed.

Another field of application of electrostatic interactions in proteins is the protein-protein association process. An interesting system is the enzyme arylsulfatase A, that builds octamers at pH values around 5 and dissociates to dimers at pH values above 6. From the crystal structure, it was suggested that this pH dependent behavior is controlled by the protonation deprotonation equilibrium of Glu424, the only titratable group in the dimer-dimer interface. I investigated the titration behavior of arylsulfatase A, when the dimers are associated or isolated and found that indeed the protonation behavior of Glu424 differs significantly. The protonation probability is larger, when the dimers are associated. This was also suggested from the interpretation of the structure: As both Glu424 are only separated by around 5 Å in the dimer-dimer interface, it would be energetically unfavorable to have both in the charged state.

The titration behavior of Glu424 also supports a second conclusion drawn from the x-ray structure determination experiments. Glu424 was found to have possibly two conformations: One conformation suitable for an intermolecular hydrogen bond that supports the dimer-dimer association, and one conformation suitable for an intramolecular hydrogen bond, preferably formed in the isolated dimers. The intermolecular hydrogen bond is formed with Glu424 protonated. The intramolecular hydrogen bond is formed with Glu424 unprotonated. The titration calculations showed, that the protonation probability of Glu424 in the dimer-dimer interface is significantly higher, when it is in the conformation suitable for the intermolecular hydrogen bond.

To account for the pH dependent behavior of the dimer-dimer association of arylsulfatase A I calculated the free energy of association in dependence of the pH-value with two different methods: A Monte-Carlo method yielding the population of the associated and isolated state and the proton-linkage model.

The first method relies on good reference energies of the associated and dissociated forms of the ASA dimer in solution. The computation of suitable reference energies is problematic. The calculations are therefore more qualitative and show, that the associated form is more stable at pH 5 than at pH 7. The main contribution to the association comes from hydrophobic interactions, which are only qualitatively considered in the calculations via a surface factor. Moreover it could be shown, that electrostatic interactions do not favor association but rather work against it. The proton linkage model provides the same pH dependence of the association energies.

The last part of this work is on the mechanism of sulfate ester hydrolysis accomplished by arylsulfatase A. The mechanism may proceed via a gem-diol in the active site of arylsulfatase A. This unusual component in an enzyme is formed by hydration of an aldehyde. The hydration of the aldehyde has to be at least as fast as the overall rate of arylsulfatase A. This seems to be only possible if it is base- or acid-catalyzed. From titration calculations I suggest, that the hydration of the aldehyde is catalyzed by a lysine residue in the active site. This lysine residue was found to be unprotonated and could therefore act as a base.

The systems investigated in this work show clearly that besides the structure of an enzyme, which is prerequisite to draw conclusions on its function, the protonation pattern has to be investigated, because it may have a large influence on the catalytic mechanism as well as on protein-protein association processes. Therefore, the electrostatic energies depending on the different protonation states must always be included, when quantitative structure activity relationships are investigated.

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# Zusammenfassung (German abstract)

In dieser Arbeit wurde die Rolle elektrostatischer Wechselwirkungen in Proteinen bei verschiedenen Prozessen untersucht. Der Schwerpunkt lag auf der Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Wechselwirkungen auf katalysierte Reaktionen und auf die Assoziation von Proteinen.

Das Protonierungsmuster des Enzyms Acetylcholinesterase wurde mit einer Monte- Carlo Titrationsmethode auf der Basis elektrostatischer Potentiale an den titrierbaren Gruppen bestimmt. Das berechnete Protonierungsmuster wies nicht alle titrierbaren Gruppen in ihrem Standardprotonierungszustand auf. Dieser Befund ließ vermuten, dass die Funktion von Acetylcholinesterase nicht allein anhand ihrer Struktur und des Standardprotonierungszustandes zu bewerten ist, der alle titrierbaren Gruppen in geladenem Zustand vorsieht, sondern dass darüber hinaus das Protonierungsmuster detailliert ermittelt werden muss.

Besonders die Rolle des Residuums Glu199, das nahe am aktiven Zentrum liegt und zwischen verschiedenen Spezies hochkonserviert ist, wurde stets diskutiert, denn die Glu199Ala Mutation zeigte nicht den deutlichen Effekt, den man erwarten kann, wenn eine geladene Gruppe durch Alanin ersetzt wird. Meine Titrationsrechnung zeigte, dass Glu199 in der Tat sowohl im freien als auch im acylierten Enzym protoniert ist. Dies erklärt den beobachteten kleinen Effekt des Mutationsexperiments sehr klar.

Die daran anschließende Frage war, ob der ungeladene Protonierungszustand von Glu199 mit dem katalytischen Mechanismus von Acetylcholinesterase in Übereinstimmung zu bringen ist. Daher habe ich den geschwindigkeitsbestimmenden Deacylierungsschritt der Acetylcholinesterase untersucht. Die Simulation dieser Reaktion wurde mit dem theoretischen Konzept der empirischen Valenzbindungsmethode (EVB) durchgeführt. Mit dieser Methode kann die freie Energie entlang des Reaktionspfades berechnet werden. Die Möglichkeiten zur Parameterisierung der EVB-Methode ermöglichen einen aussagekräftigen Vergleich der berechneten freien Energien mit experimentellen Werten, die von gemessenen Reaktionsraten abgeleitet werden können. In meinen Untersuchungen konnte ich die experimentell bestimme Reaktionsrate mit einer zufriedenstellend kleinen Abweichung reproduzieren: Die Rate, die in der Simulation berechnet wurde, liegt lediglich um den Faktor 30 unter dem experimentell bestimmten Wert. Dieses Ergebnis konnte nur dann erreicht werden, wenn das Protonierungsmuster der Acetylcholinesterase entsprechend richtig eingestellt war. Als Bestätigung der vorher angestellten Monte-Carlo Titration konnte gezeigt werden, dass Glu199 im geladenen Protonierungszustand die Rate um den Faktor 10^4 erniedrigt. Dieses Resultat unterstreicht, dass es wichtig ist, den korrekten Protonierungszustand einzubeziehen, wenn die Funktion von Enzymen untersucht werden soll.

Die Untersuchungen an Acetylcholinesterase zeigten außerdem, dass das Protonierungsmuster im aktiven Zentrum mit den üblichen Vorstellungen über den Mechanismus von Serin-Hydrolasen übereinstimmt: Das Histidin der katalytischen Triade bildet eine Wasserstoffbrücke mit mit dem Glutamat der katalytischen Triade, wobei die saure Gruppe negativ geladen ist. Aus meinen Rechungen resultierte ein Histidin, das am entsprechenden Stickstoff protoniert war, um mit Glu327 eine Wasserstoffbrücke auszubilden. Der Protonierungszustand von Glu327 wurde als negativ geladen gefunden.

Die Trajektorie der simulierten Reaktion zeigte, dass der tetraedrische Übergangszustand des Deacylierungsschrittes durch ein Oxyanion-Loch stabilisiert wird, wie es auch im Acylierungsschritt der Fall ist.

Die An- oder Abwesenheit des Cholins, dem Reaktionsprodukt des Acylierungsschrittes, beeinflusste in meinen Rechnungen weder den Protonierungszustand des Enzyms noch die Energetik der katalysierten Reaktion. Das Cholin könnte demnach während der Deacylierung noch in der Bindungstasche sein. Dies ist insofern überraschend, als dass Cholin positiv geladen ist und daher einen Einfluss auf die Eigenschaften des aktiven Zentrums haben sollte. Die nicht unterscheidbaren Resultate legen nahe, dass Cholin die Bindungstasche erst nach dem Deacylierungsschritt verlassen könnte. Dies steht im Gegensatz zu den allgemeinen Annahmen.

Ein weiteres Feld, in dem elektrostatische Wechselwirkungen von großem Interesse sind, ist die Assoziation von Proteinen. Hier ist das Enzym Arylsulfatase A (ASA) ein interessantes Fallbeispiel, denn Arylsulfatase A bildet Oktamere bei pH-Werten um 5 und dissoziiert zu Dimeren bei pH Werten über 6. Anhand der Kristallstruktur des Enzyms wurde vorgeschlagen, dass dieses pH-Wert-abhängige Verhalten durch das Protonierungsgleichgewicht von Glu424 kontrolliert wird. Ich habe das Protonierungsverhalten von Arylsulfatase A mit assoziierten und isolierten Dimeren untersucht und festgestellt, dass das Protonierungsverhalten von Glu424 in der Tat signifikant unterschiedlich ist. Die Protonierungswahrscheinlichkeit ist größer, wenn die Dimere assoziiert sind. Dies wurde auch anhand der Struktur vorgeschlagen: Da die Glu424 in der Dimer-Dimer Grenzfläche lediglich einen Abstand von 5 Å aufweisen, wäre es energetisch sehr unvorteilhaft, lägen beide im geladenen Protonierungszustand vor.

Das Titrationsverhalten von Glu424 unterstützt eine weitere Annahme, die anhand der Röntgen-struktur des Enzyms getroffen wurde: Glu424 kann in zwei Konformationen vorliegen. Eine der Konformationen ist für die Bildung einer intermolekularen Wasserstoffbrücke geeignet und würde die Dimer-Dimer Assoziation unterstützen. Die andere Konformation ist für eine intramolekulare Wasserstoffbrückenbindung geeignet, die vorzugsweise in den isolierten Dimeren gebildet würde. Die intermolekulare Wasserstoffbrücke wird mit protoniertem Glu424 gebildet. Die Titrationsrechnungen zeigten, dass die Protonierungswahrscheinlichkeit von Glu424 in der Dimer-Dimer Grenzfläche deutlich größer ist, wenn sich das Glutamat in der Konformation befindet, die die intermolekulare Wasserstoffbrücke ermöglicht.

Um das pH-Wert-abhängige Verhalten der Dimer-Dimer Assoziation von Arylsulfatase zu untersuchen, habe ich die freie Energie der Assoziation mit zwei Methoden berechnet: Mit einer Monte-Carlo Methode, die die Populierungswahrscheinlichkeiten des assoziierten und des isolierten Zustands liefert, sowie mit der Proton-Linkage Methode.

Die erste Methode beruht auf verlässlichen Referenzenergien für den assoziierten und den isolierten Zustand von ASA in Lösung. Die Berechnung dieser Referenzenergien ist jedoch problematisch. Die Resultate sind daher eher qualitativ und zeigen, dass die assoziierte Form bei pH 5 stabiler ist als bei pH 7. Der größte Beitrag zur Assoziation resultiert aus hydrophoben Wechselwirkungen, die über einen Oberflächenfaktor in die Rechnung eingehen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass elektrostatische Wechselwirkungen der Assoziation eher entgegenwirken. Das Proton-Linkage Modell zeigt die gleichen pH-Wert-Abhängigkeiten der Assoziationsenergien.

Der letzte Teil meiner Arbeit beschäftigt sich mit dem Mechanismus der Sulfatester-Hydrolyse durch Arylsulfatase A. Der Mechanismus könnte über ein geminales Diol im aktiven Zentrum von Arylsulfatase A verlaufen. Diese für ein Enzym ungewöhnliche Gruppe wird durch die Hydratisierung eines Aldehyds gebildet. Diese Hydratisierung muss mindestens ebenso rasch verlaufen wie die Gesamtreaktion von Arylsulfatase A. Das erscheint nur möglich, wenn die Hydratisierung entweder säure- oder basenkatalysiert ist. Aufgrund der Analyse von Titrationsrechnungen erscheint es möglich, dass die Hydratisierung des Aldehyds durch ein Lysin im aktiven Zentrum katalysiert wird. Dieses Lysin- Residuum wurde unprotoniert gefunden und könnte demnach als Base fungieren.

Die in dieser Arbeit untersuchten Systeme zeigen deutlich, dass neben der Struktur eines Enzyms, deren Kenntnis unabdingbar für die Beschreibung seiner Funktion ist, das Protonierungsmuster aufgeklärt werden muss, denn es kann einen starken Einfluss sowohl auf den katalytischen Mechanismus eines Enzyms als auch auf Protein-Protein Assoziationsvorgänge haben. Daher sollten die elektrostatischen Energien, die von den unterschiedlichen Protonierungszuständen abhängen, immer einbezogen werden, wenn quantitative Struktur-Funktionsbeziehungen untersucht werden.

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