Influenza viruses are major respiratory viruses, that cause annual epidemics and occasional pandemics. S-palmitoylation, the covalent attachment of long chain fatty acids to membrane proteins, is catalyzed by members of the DHHC family of protein acyl transferases. Protein palmitoylation regulates cellular processes and pathogens like Influenza viruses use the S-palmitoylation machinery of host cells to promote infection, but how substrates are recognized by DHHCs is unknown. In the first part of my work, I used the M2 protein of influenza A virus, which has one acylated cysteine at a membrane-near amphiphilic helix (AH), to study molecular determinants for palmitoylation and binding to its cognate enzyme DHHC20. After fusion of the amphiphilic helix of M2 with the fluorescent protein RFP, the reporter protein was membrane bound and palmitoylated. Changing the biophysical properties of the amphiphilic helix, its truncation, or destroying its secondary structure greatly reduced but does not eliminate the S-palmitoylation of full-length M2. Furthermore, the exchange of a kink-inducing glycine in the transmembrane (TM) region increased acylation. DHHC20, one of the enzymes involved in palmitoylation of M2, can be co-precipitated with M2 mutants and two of them bind even more strongly than M2 wildtype. Molecular dynamic simulations, performed by Clark Templeton in the group of Cecilia Clementi (Theoretical and Computational Biophysics, Free University Berlin) revealed that M2 associates via both its TM and AH with DHHC20. Amino acids of the helix interact with the catalytically important DHHC and TTXE motifs of the enzyme and some contacts are lost in M2 mutants. In the second part of my thesis, I studied the role of palmitoylation of the main glycoprotein hemagglutinin of Influenza B virus for virus replication and identified the DHHC enzymes required for the acylation. I found that palmitoylation is essential for influenza B virus replication since removing the two sites where the palmitate is attached to the HA protein or the cysteine located at the end of the cytoplasmic tail prevented generating viable viruses. Viruses with an exchange of the membrane-distal cysteine rapidly reverted back to wild-type viruses. Using Brefeldin A to block the exit of proteins from the endoplasmic reticulum (ER), I show that palmitoylation of HA of Influenza B virus occurs in the ER, whereas acylation of HA of Influenza A virus happens also in the Golgi. Infecting HAP-1 cells where genes for individual DHHCs have been inactivated revealed that HA of the Influenza B virus is acylated by the ER-localized DHHCs 1, 2, 4, and 6, which are mostly different from those previously identified to be involved in palmitoylation of HA of Influenza A virus. Overall, these results prove that palmitoylation of HA plays an essential role in the replication of Influenza B virus, as has previously been demonstrated for Influenza A virus. However, the responsible enzymes and their intracellular localization are different for Influenza A and B viruses. Overall, my research enhances our understanding of the molecular mechanisms underlying influenza virus replication and the role of S-palmitoylation in viral infection. The findings provide valuable insights into the interplay between viral proteins and host cellular processes, offering potential targets for antiviral interventions. Additionally, the identification of virus-specific differences in palmitoylation pathways emphasizes the importance of studying individual influenza strains to develop tailored therapeutic strategies.
Influenzaviren sind wichtige respiratorische Viren, die jährlich Epidemien und gelegentlich Pandemien verursachen. S-Palmitoylierung, die kovalente Bindung langkettiger Fettsäuren an Membranproteine, wird durch Mitglieder der DHHC-Familie der Proteinacyltransferasen katalysiert. Die Palmitoylierung reguliert zelluläre Prozesse und Krankheitserreger wie Influenzaviren nutzen die S-Palmitoylierungsmaschinerie von Wirtszellen, um Infektionen zu fördern, aber wie Proteinsubstrate von DHHC Enyzmen erkannt werden, ist unbekannt. Im ersten Teil meiner Arbeit habe ich das M2-Protein des Influenza-A-Virus, das an einem Cystein in einer membrannahen amphiphilen Helix (AH) acyliert ist, verwendet, um molekulare Determinanten für die Palmitoylierung und die Bindung an das Enzym DHHC20 zu untersuchen. Nach der Fusion der amphiphilen Helix von M2 an das fluoreszierenden Protein RFP war das Reporterprotein membrangebunden und palmitoyliert. Eine Änderung der biophysikalischen Eigenschaften der amphiphilen Helix, ihre Verkürzung oder die Zerstörung ihrer Sekundärstruktur verringert die S-Palmitoylierung von M2 erheblich, beseitigt sie jedoch nicht. Darüber hinaus erhöhte der Austausch eines Glycins in der Transmembranregion (TM) die Acylierung. DHHC20, eines der Enzyme, die an der Palmitoylierung von M2 beteiligt sind, kann mit M2-Mutanten co-präzipitiert werden und zwei von ihnen binden sogar stärker als der M2-Wildtyp. Molekulardynamische Simulationen, durchgeführt von Clark Templeton in der Gruppe von Cecilia Clementi (Theoretische und computergestützte Biophysik, Freie Universität Berlin), zeigten, dass M2 sowohl über seine TM als auch über seine AH mit DHHC20 assoziiert ist. Aminosäuren der Helix interagieren mit den katalytisch wichtigen DHHC- und TTXE-Motiven des Enzyms und einige dieser Kontakte gehen in M2-Mutanten verloren. Im zweiten Teil meiner Dissertation untersuchte ich die Funktion der Palmitoylierung des Hauptglykoproteins Hämagglutinin des Influenza B Virus für die Virusreplikation und identifizierte die für die Acylierung erforderlichen DHHC-Enzyme. Ich fand heraus, dass die Palmitoylierung für die Replikation des Influenza-B-Virus essentiell ist, da die Entfernung der beiden acylierten Cysteine, oder von einem Cystein am Ende des zytoplasmatischen Schwanzes die Entstehung lebensfähiger Viren verhinderte. Viren mit einem Austausch des membrannahen Cysteins verwandelten sich schnell wieder in Wildtypviren. Indem ich Brefeldin A verwende, um den Transport von Proteinen aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) zu blockieren, zeige ich, dass die Palmitoylierung des HAs des Influenza B Virus im ER stattfindet, wohingegen die Acylierung von HA des Influenza A Virus auch im Golgi passiert. Die Infektion von HAP-1-Zellen, bei denen Gene für einzelne DHHCs inaktiviert wurden, ergab, dass das HA des Influenza B Virus durch die ER-lokalisierten DHHCs Enzyme 1, 2, 4 und 6 acyliert wird. Insgesamt belegen diese Ergebnisse, dass die Palmitoylierung des HAs eine wesentliche Rolle bei der Replikation des Influenza B Virus spielt, wie bereits zuvor für das Influenza A Virus nachgewiesen wurde. Allerdings sind die verantwortlichen Enzyme und ihre intrazelluläre Lokalisierung bei InfluenzaA- und B Viren unterschiedlich. Insgesamt hat meine Forschung unser Verständnis der molekularen Mechanismen, die der Replikation des Influenzavirus zugrunde liegen, insbesondere der Rolle der S-Palmitoylierung bei der Virusinfektion verbessert. Die Ergebnisse liefern wertvolle Einblicke in das Zusammenspiel zwischen viralen Proteinen und zellulären Prozessen des Wirtes und bieten potenzielle Angriffspunkte für antivirale Maßnahmen. Darüber hinaus unterstreicht die Identifizierung virusspezifischer Unterschiede in den Palmitoylierungswegen, wie wichtig die Untersuchung einzelner Influenzastämme für die Entwicklung maßgeschneiderter therapeutischer Strategien ist.
