Hintergrund: Der Parasit Giardia duodenalis verursacht Durchfallerkrankungen im Menschen und stellt weltweit ein relevantes Risiko für die öffentliche Gesundheit dar. Geschätzt erkranken jedes Jahr 184 Millionen Menschen an Giardiasis . Vorangegangene Studien haben acht unterschiedliche genetische Gruppen identifiziert, die Assemblage A-H genannt werden. Davon sind A und B sicher humanpathogen. Verbreitete Genotypisierungsverfahren besitzen eine niedrige Auflösung und werden durch allelische Sequenzheterozygotie (ASH) - vor allem bei Assemblage B -, sowie dem Auftreten von gemischten Infektionen beeinträchtigt. Primärziel dieses Pilotprojekts war die Evaluation aktuell zur Verfügung stehender Multi-Locus-Sequenztypisierungsverfahren (MLST) in Bezug auf deren Nutzen für epidemiologische Zwecke wie der molekularen Nachverfolgung von Infektionsketten, Infektionsquellen und Ausbruchsgeschehen. Sekundärziel war die Untersuchung der Transmissionsdynamik von G. duodenalis in Deutschland. Methodik: Die menschlichen Stuhlproben für die zwei Datensätze stammten entweder aus einer Klinik für Tropenmedizin oder von vier Diagnostiklaboren. Mittels qPCR wurden Diese auf A-, B-, und gemischte A + B Infektionen untersucht (Genorte TIF, CATH) und durch MLST auf den Genorten TPI, BG, und GDH charakterisiert. Für Assemblage A konnten mithilfe von kürzlich veröffentlichten MLST weitere sechs Genorte (HCMP22547, CID1, RHP26, HCMP6372, DIS3, NEK15411) untersucht werden. Ergebnisse: Der Assemblage-Typ von G. duodenalis konnte in 175/202 (86,6 %) Personen identifiziert werden: Die Mehrheit gehörte zu Assemblage B 115/175 (65,7 %), gefolgt von A + B gemischten Infektionen 35/175 (20,0 %) und Assemblage A 25/175 (14,3 %). Mithilfe der beobachteten Rate der gemischten A + B Infektionen ließ sich die Anzahl der multiklonalen Infektionen für Assemblage A und B auf 25 % bzw. 50 % schätzen. Die MLST Analyse erfolgte inklusive ASH mittels einer neu entwickelten reziproken Ausreißeranalyse und konnte für Assemblage B im ersten und zweiten Datensatz jeweils 6/9 (66,7 %) und 4/5 (80,0 %) der Proben von chronisch infizierten Erkrankten richtig zuordnen. Zusätzlich wurde ein Cluster von fünf verschiedenen, mit Assemblage B infizierten, Personen identifiziert, der ein identisches MLST-Profil aufwies. Das kürzlich veröffentlichte MLST Schema für Assemblage A erhöhte die Sensitivität der Zuordnung von Stuhlproben chronisch infizierter Erkrankter. Es konnten 5/6 (83,3 %) Personen richtig identifiziert werden. Zusätzlich wurden 15 neue Genotypen charakterisiert. Schlussfolgerung: Aktuell verfügbare Typisierungsverfahren lassen sich für epidemiologische Fragestellungen gewinnbringend nutzen. Assemblage A und B benötigen dabei verschiedene Protokolle und Auswertungsstrategien. Bei der Interpretation von MLST-Ergebnissen sollten polyklonale Infektionen und ASH berücksichtigt werden. Dieses Paper sensibilisiert für diese Herausforderungen und zeigt einen Lösungsansatz auf.
Background: The protozoan parasite Giardia duodenalis causes diarrheal disease in humans and represents a relevant public health risk worldwide. An estimated number of 184 million symptomatic cases are recognised globally per year. Previous studies identified eight distinct genetic groups (referred to as assemblage A-H) of which A and B are pathogenic to humans. Combined molecular and epidemiological data are largely lacking, partly due to low discriminatory power of current genotyping techniques, which is impeded by allelic sequence heterozygosity (ASH) mainly in assemblage B, and by occurrence of mixed infections. This pilot project assessed the suitability of current genotyping protocols of G. duodenalis assemblages A and B for epidemiological applications, such as molecular tracing of transmission chains, source attribution and outbreak investigations. A secondary objective was to investigate transmission dynamics of G. duodenalis in Germany. Methods: Two sets of human stool samples, one from an outpatient tropical medicine clinic and the other from four primary care laboratories, were collected. Specimens were evaluated by real-time PCRs to detect mixed infections (TIF, CATH gene loci) and characterised using a common multi locus sequence typing (MLST) scheme of TPI, BG, GDH gene loci. Additionally, six recently published loci for assemblage A (HCMP22547, CID1, RHP26, HCMP6372, DIS3, NEK15411) were investigated. To improve the analysis of common MLST data for assemblage B, a reciprocal outlier analysis was newly developed. Results: The G. duodenalis assemblage type could be identified in 175/202 (86.6 %) persons: The majority belonged to assemblage B 115/175 (65.7 %), followed by A + B mixed infections 35/175 (20.0 %) and assemblage A 25/175 (14.3 %). Using the observed A + B mixed infection rate, we estimated that 25 % and 50 % of assemblage A or B cases represented multiple strain infections. Typing results were concordant with that prediction. Including allelic sequence heterozygosity into MLST investigation and using a newly developed reciprocal outlier analysis, we could correctly identify 6/9 (66.7 %) and 4/5 (80.0 %) subsequent samples from chronic assemblage B infected patients in the two sample collections, respectively. Additionally, we detected a cluster of five patients carrying independently assemblage B type G. duodenalis of an identical MLST type. Recently developed six gene MLST for assemblage A greatly increased sensitivity and identified 5/6 (83.3 %) subsequent samples from chronic assemblage A infected patients. Furthermore, we discovered 15 novel genotypes. Conclusion: Considering different typing protocols and analytic tools for assemblages A and B, implementation of MLST for epidemiological purposes is possible. Polyclonal infections and ASH should be incorporated in MLST sequence analysis. This study sensitizes regarding these challenges and presents an approach to solution.
