Cholesterol-dependent cytolysins (CDC) are acknowledged virulence factors of a wide range of pathogenic gram-positive bacteria like Streptococci, Clostridia, and Listeria etc. CDC selectively target membranes that contain cholesterol and induce pathogenesis in the host organisms by versatile mechanisms. Bacteria release CDC during an infection, which infuriate the infection and the treatment of infection becomes challenging with the contemporary regime of anti-infectives. The noxious responses of CDC include direct toxicity via pore formation, manipulation of cellular signaling to promote bacterial survival and evasion of the immune system. Worldwide, millions of deaths are associated with CDC like PLY, PFO, LLO etc. Therefore, CDC have been considered as a potential target for drugs. In the research of the last few decades, multiple natural and synthetic small molecules have been proposed as anti-toxins, however, due to lack of specificity, none of them were contemplated for clinical testing. Thus, to date there is no specific treatment available to counter CDC manifestations and the goal of this project is to develop and validate specific small molecules against CDC. PLY was selected as a prototype CDC for testing of small molecules. In our earlier work, a model of PLY-pore was developed to virtually screen half a million molecules from online databases that could block the oligomerization and ultimately pore formation of PLY. Pore-Blocker-1 (PB-1), was the only molecule that actively inhibited PLY in a hemolysis assay and, thereon, its optimization led to the discovery of PB-2 with ten times improved activity. In this dissertation, PB-1 and 2 were validated in the BLI assay. Cryo-TEM analysis showcased that PB-2 prevented the PLY penetration in membranes of cholesterol-liposomes. By analyzing several closely related derivatives of PB-2 the pharmacophore of inhibitors was identified, which enabled the effective alteration of scaffolds to produce PB-3, a more chemically stable and potent inhibitor of PLY. PB-3 exhibited an IC50 of 3 µM in the hemolysis assay and a KD value of 256 nM against PLY in the BLI assay. Analogous potency of PB-3 was observed in the LDH assay and cellular microscopy. PB-3 was generated and quantified through the protein-catalyzed ligation of precursor fragments. The actual mechanism of inhibitors was unveiled by evaluating the activity of inhibitors against multiple PLY-mutants and in contrast to the virtually proposed mechanism of binding, a cysteine mutant of PLY suggested that PB-3 might be binding to a cysteine in the membrane-binding domain of PLY. Then, BLI and MS investigations of cysteine mutant PLY and wild type confirmed the cysteine-mediated reversible covalent interaction between PB-3 and PLY. Afterwards, PB-3 was observed barely active against other cysteine-proteases (PTP-1B and SARS-CoV2), confirming the increased affinity of PB-3 toward PLY. PB-3 blocked PLY in a bacterial infection-model assay, this experiment further affirms selectively of PB-3 to PLY because the cell culture medium contained 13000-fold more free-cysteine than PLY. Finally, PB-3 was examined against two further CDC, PFO and ILY. PFO is analogous to PLY and possesses a cysteine residue in the undecapeptide and when PB-3 was tested, it was nearly 10 times more potent against PFO than PLY. Conversely, ILY is devoid of cysteine and PB-3 was expectedly inactive against ILY. In the light of these results, we presumably consider PB-3 as an inhibitor of cysteine-containing CDC.
Cholesterin-abhängige Cytolysine (CDC) sind anerkannte Virulenzfaktoren einer breiten Palette pathogener grampositiver Bakterien wie Streptokokken, Clostridien und Listerien usw. CDC zielen selektiv auf Membranen ab, die Cholesterin enthalten, und induzieren die Pathogenese in den Wirtsorganismen durch vielseitige Mechanismen. Bakterien setzen während einer Infektion CDCs frei, die die Invasivität der Infektion erhöhen, und die Behandlung von Infektionen wird mit der derzeitigen Therapie mit Antiinfektiva zu einer Herausforderung. Zu den schädlichen Reaktionen von CDC gehören die direkte Toxizität über die Porenbildung, die Manipulation der zellulären Signalübertragung zur Förderung des bakteriellen Überlebens und die Umgehung des Immunsystems. Millionen von Todesfällen weltweit sind mit CDC wie PLY, PFO, LLO usw. verbunden. Daher wurden CDC als potenzielles Arzneimittelziel angesehen. Während der Forschung der letzten Jahrzehnte wurden mehrere natürliche und synthetische kleine Moleküle als Antitoxine vorgeschlagen, aufgrund mangelnder Spezifität wurde jedoch keines von ihnen für klinische Tests in Betracht gezogen. In unserer früheren Forschung wurde ein Modell von PLY-Poren entwickelt, um virtuell eine halbe Million Moleküle aus Online-Datenbanken zu Screening, die die Oligomerisierung und letztendlich die Porenbildung von PLY blockieren könnten. Pore Blocker-1 (PB-1) war das einzige Molekül, das PLY in einem Hämolyse-Assay aktiv hemmte, und seine Optimierung führte anschließend zur Entdeckung von PB-2 mit zehnfach verbesserter Aktivität. In dieser Dissertation wurden PB-1 und 2 mit dem BLI-Test validiert. Die Cryo-TEM-Analyse zeigte, dass PB-2 das Eindringen von PLY in die Membranen von Cholesterin-Liposomen verhinderte. Das Pharmakophor der Inhibitoren wurde durch die Analyse mehrerer eng verwandter Derivate von PB-2 identifiziert, was eine effektive Veränderung der Gerüste ermöglichte, um PB-3, einen chemisch stabileren und stärkeren Inhibitor von PLY, zu entwickeln. PB-3 hatte eine IC50 von 3 µM im Hämolyse-Assay und einen KD-Wert von 256 nM für PLY im BLI-Assay. Eine ähnliche Wirksamkeit von PB-3 wurde im LDH-Assay und in der Zellmikroskopie nachgewiesen. PB-3 wurde durch die protein-katalysierte Ligation von Precursor-Fragmenten erzeugt und quantifiziert. PB-3 wurde durch die Proteintemplat-unterstützte Ligation von Precursor-Fragmenten erzeugt und quantifiziert. Der wahre Mechanismus der Inhibitoren wurde durch die Auswertung der Aktivität der Inhibitoren gegen mehrere PLY-Mutanten entdeckt. Im Kontrast zu dem virtuell vorgeschlagenen Bindungsmechanismus deutete eine Cystein-Mutante von PLY darauf hin, dass PB-3 an ein Cystein in der Membran-Bindungsdomäne von PLY binden könnte. Anschließend bestätigten BLI und MS Untersuchungen der Cystein-Mutante PLY und des Wildtyps die Cystein-vermittelte reversible kovalente Interaktion zwischen PB-3 und PLY. Im Anschluss daran wurde PB-3 als kaum aktiv gegen andere Cystein-Proteasen (PTP-1B und SARS-CoV2) identifiziert, was die erhöhte Affinität von PB-3 gegenüber PLY bestätigt. PB-3 blockierte PLY in einem bakteriellen Infektionsmodell-Assay. Dieses Experiment bestätigt außerdem die Selektivität von PB-3 für PLY, da das Zellkulturmedium 13000-mal mehr freies Cystein als PLY enthielt. Zum Schluss wurde PB-3 gegen zwei weitere CDC, PFO und ILY, getestet. PFO ist analog zu PLY und enthält Cystein, und bei der Prüfung von PB-3 wurde festgestellt, dass es fast zehnmal stärker gegen PFO wirkt als PLY. Umgekehrt ist ILY frei von Cystein und PB-3 war erwartungsgemäß inaktiv gegenüber ILY. In Anbetracht dieser Ergebnisse halten wir PB-3 vermutlich für einen Hemmstoff gegen Cystein-haltiges CDC.
